酶與抗體交聯(lián)的方法有許多種，根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)不同可采用不同的方法。對于制備 HRP結(jié)合物，可用戊二醛二步法和過碘酸鈉發(fā)。尤以簡易過碘酸鈉法更為常用。

戊二醛二步法

1、原理:戊二醛為一種雙功能試劑，通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價結(jié)合，形成酶—戊二醛—免疫球蛋白結(jié)合物。

2、標記步驟

(1）稱取HRP25mg溶于12.5mL/L戊二醛溶液中，于室溫靜置過夜。

(2)反應后的酶溶液經(jīng)SephadexG-25層析柱,用生理鹽水洗脫。流速控制在1mL/min，收集棕的流出液。如體積大于5mL，則以PEG濃縮至5mL。放置25mL小燒杯中，緩慢攪拌。

(3）將待標記的抗體112.5mg用生理鹽水稀釋至5mL，攪拌下逐滴加入酶溶液中。

(4）用1M pH9.5碳酸鹽緩沖液0.25mL，繼續(xù)攪拌3~4小時。

(5）加0.2M 賴氨酸0.25mL，混勻后，置室溫2小時。

(6）在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1小時。

(7） 3000rpm/min離心 30min，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M、pH7.4的PBS中。

(8)將上述溶液裝入透析袋中，對0.15M、pH7.4的PB緩沖液透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測)，10000rpm/min離心30min去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保存。

3、結(jié)果判定

(1）定性及效價測定:用特異性抗原(或抗體）同酶標記抗體(或抗免疫球蛋白抗體)作雙向瓊脂擴散實驗或免疫電泳試驗。然后用酶的底物使沉淀弧顯色，可初步鑒定其活性。最后以直接ELISA(或正式實驗系統(tǒng)里)對酶結(jié)合物進行滴定（見(三）工作濃度的選擇)。

(2）本法標記步驟比較簡單，重復性好，缺點是酶的利用率低，一般只有2%~4%的酶與蛋白質(zhì)結(jié)合。

4、試劑和器材

( 1)0.1M、pH6.8磷酸鹽緩沖液(PBS):取0.2M Na2HPO4 49mL ,0.2M NaH2PO4 51mL,NaCl 1.8g，加蒸餾水至200mL。

(2) 12.5mL/L戊二醛液:取250mLL戊二醛50mL與 pH6.8的PBS確? mL混合。

(3)  1M、pH9.5碳酸鹽緩沖液(PBS):取 1M Na2CO3 3mL與1M NaHCO3 7mL混合。

(4) 0.2M賴氨酸溶液:稱賴氨酸29.2mg溶于0.01M、pH9.5碳酸鹽緩沖液1mL中。

(5) 0.15M、pH7.4的PBS及生理鹽水。

(6） pH7.8飽和硫酸銨溶液及半飽和硫酸銨溶液。

(7） 萘氏試劑及聚乙二醇(PEG、MW2000)

(8）純化的特異性抗體或抗lg抗體。

(9）HRP(RZ>3.0)。

(10）SephadexG-25層析柱（2cmX50cm)。

(11）攪拌器、分光光度計、離心機。

(12）透析袋、大小燒杯，試管，吸管等。

簡易過碘酸鈉法

本法是以NaIO4先將HRP表面的糖分子氧化成醛基,然后再與lg上的氨基相結(jié)合,所獲酶標記抗體的產(chǎn)率高,將近70%的HRP和Ig 結(jié)合,99%的Ig 與酶集合,酶與Ig的活性無重大損失,是目前最常用的方法.

1、原理:**的過碘酸鈉法中需采用二硝基氟苯封閉HRP上殘留的a-和e氨基以避免酶分子之間的交聯(lián)。后來Wilson等改用在低 pH下使NalO4氧化HRP，從而省去了二硝基氟苯封閉HRP步驟。HRP經(jīng)NaIO4氧化后形成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連，形成斯夫氏堿，后者可進一步用兵NaBH(或乙醇胺）還原生成穩(wěn)定的酶標記抗體。

2、標記步驟

(1）稱取5mgHRP溶解于1mL蒸餾水中。

(2）于上液中加入0.2mL新配的0.1M NaIO4溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。

(3）將上述溶液裝入透析袋，對1mM, pH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過夜。

(4）加20pL 0.2M pH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化物的pH升高到9.0~9.5，然后立即加入10mglgG，室溫避光輕輕攪拌2小時。

(5）加0.1mL新配的 4mg/mL NaBH4液，混勻，再置4℃2小時。

(6）將上述溶液裝入透析袋，對0.15M,pH7.4PBS 透析，4℃過夜。

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