β一微球蛋白分子量為11.8KD,是一種相對較小的蛋白質.β一微球蛋白存在于除紅細胞和胎盤滋養(yǎng)層細胞以外的所有有核細胞，尤其在淋巴細胞和單核細胞中含量豐富，在其免疫應答中起重要作用．資料顯示,在白血病、**和其他一些患者中β一微球蛋白含量比正常人高．用雙抗體夾心法定量酶聯免疫吸附試驗確定正常人和患者的β一微球蛋白量分界限(cut一off值),可為疾病檢測建立一種方法．本文酶標二抗的制作為定量ELISA試驗的一個重要環(huán)節(jié).

主要試劑

Tris一HCl緩沖溶液(羥甲基胺基甲烷—一鹽酸的緩沖溶液);Sephacryl S—300:裝柱料S—300凝膠是由烯丙基葡萄糖與N,N'一亞甲基雙丙烯酰胺共價交聯制備的剛性凝膠等.

方法

酶標抗體的制備  其步驟如下:

1) 取0.2 M碳酸氫鈉水溶液2 mL裝入試管中，加入HRP20 mg 使其溶解,溶液呈褐色.

2）緩慢地加入0.06 M過碘酸鈉溶液2 mL,在4℃條件下,放置1 h

3）迅速加入0.16 M 乙二醇一氯化鈉水溶液2 mL，置室溫下30 min.

4)加入無水乙醇24 mL，以1 500 r/ min離心30 min,棄取上清液,沉淀中加7 DW 10 mL溶解,分成兩份,加入β2一微球蛋白單克隆40 mg,0.67 mL包被液在4℃下放置過夜

5）加入70uL硼氫化鈉,0.33 mL磷酸二氫鈉，然后上 Sephacry l S~300柱.

用蛋白純化儀純化酶標抗體結合物的Tris一HCI緩沖溶液加到柱長的1/4處,然后將漂洗溶脹的SephacrylS—300傾入柱中，自然沉降30min,再用同樣的緩沖液平衡柱1 h,流速0.7 mL min,調節(jié)紫外檢測儀和其他收集器,使收集樣品的量為6.0 mL/管，加樣量為50OuL.

酶標抗體檢測 用定量免疫學方法(ELISA)檢測各部分洗脫液的抗體

分裝蛋白 將6Es,7Hs得到的蛋白質在蛋白檢測儀中測蛋白質在波長260、280.320 nm 處的吸收度,根據1.45×A28o一0.74×A2so計算蛋白質的量(mg/mL),剩余蛋白質進行分裝。通過檢測將6Es在第4峰時的分餾物加對半量甘油,以 800 4L/支分裝,共裝12支,在一4℃冷凍保存．將7Hs在**,第三峰時的分餾物加對半量甘油，以800 4L/支分裝,其中**峰共裝19支,第三峰共裝17支,在一4℃冷凍保存.

6Es酶標抗體結合物的分離純化結果﹒

Ⅰ峰:β2-微球蛋白與過氧化物酶的結合物;II峰:未結合的物質

圖1  6E，酶標抗體結合物的分離純化

Ⅰ峰:β2一微球蛋白與過氧化物酶的結合物;II峰:未結合的物質

圖2  7H5酶標抗體結合物的分離純化圖

酶標抗體結合物蛋白濃度測定結果

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