螢火蟲熒光素酶是一個61kDa單亞基蛋白質(zhì),酶活性不需翻譯后修飾(3,4)。因此，一旦翻譯完成即具有遺傳報告基因的功能。在ATP,Mg和 O存在下，通過甲蟲熒光素的氧化反應(yīng)放出光子(圖1)。在傳統(tǒng)反應(yīng)條件下，熒光素的氧化要經(jīng)過一個熒光素-AMP中間體，轉(zhuǎn)換非常緩慢。結(jié)果，這種檢測化學在底物和酶混合后產(chǎn)生一種"閃爍"光，并迅速衰減�，F(xiàn)在，普洛麥格公司在獲得專利的定量檢測螢火蟲熒光素酶活性的試劑中加入了輔酶A(CoA)，通過加快酶轉(zhuǎn)換(5)提供改進的反應(yīng)動力學，從而得到延長的"輝光"熒光信號(圖2)。

海腎熒光素酶是一個36 kDa單亞基蛋白質(zhì)，純化自自然界來源的Renilla reniformis"%) ,含有3%的碳水化合物。如同螢火蟲熒光素酶，海腎熒光素酶的活性也不需要翻譯后修飾，一旦翻譯完成即可行使遺傳報告基因的功能。海腎熒光素酶利用Oz和腔腸熒光素(coelenterazine)催化發(fā)光反應(yīng)(圖1)。當應(yīng)用DLR檢測化學操作時，海腎熒光素酶的反應(yīng)動力學產(chǎn)生輝光型熒光信號，并在測量過程中緩慢地衰減(圖2)。

圖1．由螢火蟲和海腎熒光素酶所催化的生物發(fā)光反應(yīng)

圖⒉用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測到的螢火蟲和海腎熒光素酶產(chǎn)生的熒光。

在DLR檢測系統(tǒng)中，螢火蟲和海腎熒光素酶的活性是從同一裂解液中分步測量的。在完成螢火蟲熒光素酶活性("實驗"報告基因)的測量后，螢火蟲熒光被快速淬滅，并在這同時激活海腎熒光素酶的熒光反應(yīng)("對照”報告基因的活性)。因此，DLR檢測系統(tǒng)綜合了兩個檢測化學，對來自轉(zhuǎn)染細胞裂解液或無細胞轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)中共同表達的兩個報告基因快速地提供定量結(jié)果。

螢火蟲熒光素酶檢測的線性范圍延伸達酶濃度的8個數(shù)量級,可檢測≤lfg(大約10摩爾)的實驗報告基因酶(圖3A)。用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)，海腎熒光素酶的線性范圍達酶濃度的7個數(shù)量級，對照報告基因酶檢測的底限≤10fg(大約3×101摩爾)(圖3B)。此外，這兩個酶表現(xiàn)的特異性活性相似。

用pGL3 -Control和pRL-SV40載體DNA共同轉(zhuǎn)染CHO細胞(1×10°個細胞/60mm培養(yǎng)).細胞用PBS洗滌后,加入400ul的 PLB并刮下細胞，制成裂解液。分出 20ul 的細胞裂解液，并將其和100ul的熒光素酶檢測試劑II(LARII)混合，立即用熒光發(fā)光計測量螢火蟲熒光素酶的活性(綠線)。然后，在熒光發(fā)光計試管中加入100ul的 Stop &GloTM試劑，以淬滅螢火蟲熒光素酶反應(yīng)，同時激活海腎熒光素酶反應(yīng)，并立即測量海腎熒光素酶的活性(藍線)。此實驗使用Turner Designs型號20e熒光發(fā)光計,配合一臺計算機來示蹤在12秒鐘檢測時間段內(nèi)的熒光發(fā)射情況。

圖3.螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶發(fā)光反應(yīng)的線性范圍。

純化的螢火蟲和海腎熒光素酶經(jīng)含有1mg/ml BSA的1xPLB緩沖液連續(xù)稀釋。使用配有計算機的Turner Designs 熒光發(fā)光計20e型，在經(jīng)過一個初始2秒的預(yù)讀延遲后，確定兩種熒光素酶在各種不同濃度時，在10秒鐘內(nèi)的總熒光。

圖4.用手動操作的熒光發(fā)光計，或配有一支試劑進樣器的熒光發(fā)光計進行雙熒光素酶檢測的方法。

如果熒光發(fā)光計配有兩個進樣器，則將裂解的樣品預(yù)先分裝到熒光發(fā)光計的試管中，隨后按次序自動加入LuciferaseAssay Reagent II(LAR I)和 Stop & GloTM試劑。

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