非水相酶學(xué)的研究對(duì)于加深理解酶在天然環(huán)境中的性質(zhì)具有重要意義，Ryu等曾用辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP，E.C.1,11,1,7)研究了非水溶劑對(duì)酶的結(jié)構(gòu)和功能的影響.由于過(guò)氧化物酶在HgO存在下能催化氧化許多有機(jī)物，并且水不參與反應(yīng)，催化聚合的芳香胺類和酚類具有高度共扼的大T鍵結(jié)構(gòu)，故具有誘人的應(yīng)用前景.HRP在有機(jī)溶劑中的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)已有較詳細(xì)的報(bào)道，而在水相膠束體系的酶學(xué)性質(zhì)卻未見(jiàn)報(bào)道.

  為解決底物的溶解度問(wèn)題．我們引入了水相膠束體系進(jìn)行芳香胺類的聚合，通過(guò)比較3種**的在水相膠束中具有不同增溶位置及帶有不同量親水、疏水基團(tuán)的芳香胺類，如苯胺、二苯胺和聯(lián)苯胺在有機(jī)溶劑及水相膠束體系的酶促動(dòng)力學(xué)常數(shù)，來(lái)探索水相膠束體系中底物微環(huán)境對(duì)酶促反應(yīng)的影響和機(jī)制.

實(shí)驗(yàn)部分

辣根過(guò)氧化物酶RZ~3.0，比活>250 U/mg.其它試劑均為分析純.

  向50%的二氧六環(huán)或69 mmol/L的十二烷基磺酸鈉(SDS)(溶劑為pH=6.0、20 mmol/L磷酸緩沖液)中加入一定量的底物，于25℃振搖24 h.取出1 ml.加入比色池中，再加入4.26 mmol/L的HRP和2.27的HO:，測(cè)定其底物的熒光減少速率(Hitachi-850型熒光分光光度計(jì))．再根據(jù)底物濃度和熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線算出反應(yīng)初速度，以底物濃度和反應(yīng)初速度作Linewear-Rurk圖，求出動(dòng)力學(xué)常數(shù).

結(jié)果與討論

  圖1為具有不同親疏水基團(tuán)比例的3種底物在69 mmol/L SDS體系與50%二氧六環(huán)體系中的動(dòng)力學(xué)特性.由于反應(yīng)活性的差異，在測(cè)定苯胺的動(dòng)力學(xué)常數(shù)時(shí)采用了不同濃度的HRP.

圖1

  從表1可以看出，體系不同，3種底物的Km值均有變化，且在50%二氧六環(huán)體系中Km值均小于SDS體系．說(shuō)明在有機(jī)相中酶對(duì)底物的親和力比在膠束體系中更大，這與底物本身是兩親性分子，其在膠束的兩親環(huán)境中分配系數(shù)較在有機(jī)相中更大是一致的.Ka./Km也表現(xiàn)了同一趨勢(shì)，3種底物在SDS體系中的Kea./K。值均比在50%二氧六環(huán)體系中要高，說(shuō)明酶在SDS膠束體系的催化效率比在有機(jī)相中的高.

  研究結(jié)果表明，與有機(jī)溶劑相比，在緩沖液體系中HRP與底物的親和力更強(qiáng)，催化效率也更高．而我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在水相膠束體系中HRP比在有機(jī)溶劑中催化效率更高，但與底物的親和力更低．因此，我們認(rèn)為在水相膠束體系中，HRP是在一個(gè)既不同于緩沖溶液體系，又不同于有機(jī)溶劑體系的微環(huán)境中進(jìn)行酶促反應(yīng)的，即在一個(gè)較嚴(yán)格的親/疏水界面反應(yīng).

  酶在水相膠束體系中所表現(xiàn)出的這種與底物親和力降低，但催化效率反而升高的特點(diǎn)恰與酶進(jìn)化的趨勢(shì)相吻合，這或許能體現(xiàn)生物膜進(jìn)化與酶進(jìn)化的趨同性．就K。而言，苯胺在SDS體系比在二氧六環(huán)體系中提高了15倍，使用二苯胺時(shí)提高了近一倍，而使用聯(lián)苯胺時(shí)僅提高了～30%﹔而Kea./Km的變化趨勢(shì)卻是聯(lián)苯胺提高得更多，二苯胺次之，苯胺更小K值的大小可以反映出酶與底物親和能力的強(qiáng)弱，但在不同的微環(huán)境中﹐酶與底物的親和能力會(huì)受到不同程度的影響﹑由于3種底物的親疏水基團(tuán)比例不同，故在水相膠束體系中，底物在膠束中的增溶位置在很大程度上影響著酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)，并對(duì)不同常數(shù)具有不同的影響，具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究.

  水相膠束體系是一種微多相的反應(yīng)介質(zhì)，表面活性劑分子聚集形成的膠束以一種微多相的方式存在于大量的水體系中．在催化反應(yīng)的過(guò)程中，酶處于水相中，有利于酶的催化.但由于游離的表面活性劑分子及由表面活性劑分子構(gòu)成膠束的存在，這種微環(huán)境又不完全與水相同.同時(shí)，在水相膠束中，底物被增溶，并被限制在由表面活性劑分子構(gòu)成的膠束中，酶對(duì)底物的催化作用在膠束和水之間的界面上進(jìn)行，故底物不同于在水及有機(jī)溶劑中的游離狀態(tài)．因此，研究酶在水相膠束體系中的催化特性可以優(yōu)化反應(yīng)條件，以利于控制反應(yīng)的進(jìn)行.

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