用酶標(biāo)記各種特異性配體(抗體、抗原等),利用酶的催化放大作用和特異性作用而建立的標(biāo)記免疫分析叫做酶免疫分析( enzyme immunoassay，EIA) "。在酶免疫分析中將在酶催化作用下產(chǎn)生新化合物的物質(zhì)統(tǒng)稱為底物。一種酶能催化特定的底物,將其轉(zhuǎn)化為有可檢測(cè)信號(hào)的產(chǎn)物。酶僅使底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物,本身在反應(yīng)過程中并不消耗,反復(fù)起催化作用,將信號(hào)放大。傳統(tǒng)的EIA 采用色原底物測(cè)量可見光的吸光度,隨著酶免疫分析技術(shù)的發(fā)展,出現(xiàn)了靈敏度更高的放射性底物、熒光底物和化學(xué)發(fā)光底物,而改為測(cè)量釋放的射線、熒光和化學(xué)發(fā)光。由于采用放射性底物存在接觸和處理放射性物質(zhì)的危險(xiǎn),而隨后出現(xiàn)的熒光和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的靈敏度已經(jīng)達(dá)到或超過該方法,因此放射性底物出現(xiàn)后不久即很少使用。目前常用于EIA 的酶包括如下3種:辣根過氧化物酶( horseradish peroxidase , HRP)、堿性磷酸酶( alka-line phosphatase ,AP)及β-D-半乳糖苷酶( B-D-galactosidase,CAL)。其中 HRP分子小,易于與蛋白耦聯(lián),而且呈色性好,應(yīng)用廣泛,因此對(duì)HRP底物的研究在基于酶的分析檢測(cè)中具有非常重要的意義。本文對(duì)近年來HRP底物的研究進(jìn)展作一綜述。

色原底物

早期HRP底物是色原,常規(guī)的色原底物在酶作用下產(chǎn)生一種新的顏色(或者吸收光譜發(fā)生改變),這種檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)在于產(chǎn)生的顏色很容易用肉眼或光譜儀器檢測(cè),檢測(cè)儀器的價(jià)格一般也比其他檢測(cè)方法所用的儀器便宜;缺點(diǎn)是檢測(cè)靈敏度普遍低于其他酶檢測(cè)方法。

色原底物的基本結(jié)構(gòu)可用變化多樣的芳香族胺和酚表示,大多數(shù)芳香胺,酚和它們的混合物在酶促氧化時(shí)會(huì)產(chǎn)生有色的縮聚物。常見的芳胺類色原底物包括:鄰苯二胺( OPD),四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、2,2'-連氮-雙-(3-乙基苯噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、5-氨基水楊酸(5-AS),鄰聯(lián)二茴香胺( ODA),鄰聯(lián)甲苯胺(OT)等1。部分色原底物的分子結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1部分色原底物的分子結(jié)構(gòu)式

3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)和3,6-二氨基-9-乙基咔唑常用于過氧化物酶的活性染色。Krieg 等'將AEC連接鰲合的N-芐基部分,得到-類新型的N-芳基甲基-苯胺色原底物(通用結(jié)構(gòu)式見圖2)。其制備方法是將AEC或3,6-二氨基-9-乙基咔唑與芳香醛混合濃縮,隨后將濃縮產(chǎn)物Schiff堿用NaBH,還原即可。與傳統(tǒng)的芳胺類色原底物相比,這種新型底物的靈敏度和適用性等得到很大改進(jìn)。

圖2 3-(N-芳基甲基)氮基9-乙基咔唑(X=OH，NHR)

結(jié)論

HRP在酶免疫分析中占有重要地位。在前述的三類主要HRP底物中,早期的色原底物檢測(cè)靈敏度不高,隨后發(fā)展起來的熒光底物和化學(xué)發(fā)光底物**提高了靈敏度,但面臨的共同問題是檢測(cè)儀器價(jià)格昂貴,從而限制了其應(yīng)用。另外這兩種底物自身也都存在一些缺陷:熒光信號(hào)易飽和,易猝滅,以及自發(fā)熒光對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾;化學(xué)發(fā)光必須隨時(shí)采集,光積分時(shí)間長(zhǎng)等。與之相比,納米金底物具有-一系列突出優(yōu)點(diǎn):靈敏度高,納米金顆粒的消光系數(shù)比色原底物和熒光基團(tuán)高大約1000倍;檢測(cè)成本低,采用電鏡甚至目視即可檢測(cè);沉積金屬非常穩(wěn)定,使檢測(cè)信號(hào)容易得到恒定值,等等。納米金底物已經(jīng)作為新型的標(biāo)記探針,用于免疫組化中稀有組織抗原的高靈敏度檢測(cè)。

相關(guān)產(chǎn)品供應(yīng)

HRP-sulfadimethoxine 磺胺地索辛

HRP-anisamide茴香酰胺

HRP-Estrogen 雌性激素

HRP-Adamantine Ad金剛烷

HRP-Azithromycin  阿奇霉素

HRP-NTA-NI  氮川三乙酸-鎳

HRP-NH2  Amine  氨基

HRP-COOH  carboxyl 羧酸

HRP-MAL  Maleimide 馬來酰亞胺

HRP-NHS  N-羥基琥珀酰亞胺

HRP-N3  azide 疊氮

HRP-Alkyne 炔基

HRP-SH Thiol 炔基

HRP-Biotin  生物素

HRP-CHO aldehyde 醛基 乙醛

HRP-OPSS 鄰吡啶二硫 巰基吡啶

HRP-OH hydroxyl 羥基

HRP-Hydrazide, HZ 酰基

HRP-Silane 硅烷

HRP-DBCO 二苯基環(huán)辛炔

HRP-TCO

HRP-TZ  Tetrazine, 四嗪

HRP-Folate ，FA， folic acid  葉酸

HRP-TPP 磷酸三苯酯

HRP-Dopamine 多巴胺

HRP-Ferrocene 二茂鐵

HRP-DOTA 四氮雜環(huán)十二烷四乙酸

HRP-NOTA

HRP-Dansyl  丹磺酰氯