穩(wěn)定同位素標(biāo)記的高維度代謝組學(xué)用于識別植物中缺失的特征代謝

    特征代謝的確切機制及其在植物進化中的重要性仍然是個謎。特征代謝的產(chǎn)物及其相應(yīng)的生物合成基因?qū)τ诶斫饽承┐�謝普遍存在的原因至關(guān)重要。盡管基于質(zhì)譜（MS）的代謝組學(xué)使我們能夠獲得未知特征代謝物、已知代謝物及其對應(yīng)異構(gòu)體或類似物的結(jié)構(gòu)特征數(shù)據(jù)，但分析方法的拓展仍然**必要。在此，回顧總結(jié)了使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記識別未知特征代謝物的**分析方法。

    迄今，地球上大約391000種維管植物中的225種基因組已被測序。由于測序及數(shù)據(jù)分析技術(shù)方法的進步，預(yù)計這一數(shù)字在不久的將來會迅速增加�，F(xiàn)代基因組測序能做到一個物種的全基因組分析或染色體規(guī)模的基因組分析。這些方法可用于從測得的基因組中獲得相關(guān)代謝類型的詳細(xì)信息。

   植物有兩種代謝類型，即初級代謝，次級代謝或特殊代謝。初級代謝對于維持植物的生存**必要，其與包括氨基酸、糖、脂肪酸和脂類在內(nèi)的代謝物息息相關(guān)，且在進化早期即形成，存在于所有已知的植物中。而植物進化出特殊代謝的原因尚不明確；過去十年的研究表明，特殊代謝產(chǎn)物能保護植物抵抗環(huán)境脅迫，包括生物和非生物脅迫。為了確定特殊代謝物的作用，對相關(guān)生物合成基因修飾或缺失導(dǎo)致缺乏此類特殊代謝物的植物進行比較分析是必不可少的。例如，通過對比野生型和突變體的類黃酮生物合成途徑，能闡明代謝物對氧化和干旱相關(guān)脅迫的作用。各種野生型物種的比較遺傳分析揭示了�；�類黃酮對紫外線-B具有緩解作用，表明當(dāng)植物暴露在嚴(yán)重的脅迫下時，它們會過度產(chǎn)生特殊的代謝物，表現(xiàn)出一定的緩解脅迫的能力。

     已有研究表明，參與代謝的剩余基因仍然存在于基因組中；然而，由于對應(yīng)代謝物未被識別，對應(yīng)基因的功能因此也未能被確認(rèn)。因此，要確定相應(yīng)基因的功能，必須揭示相應(yīng)的代謝物。每一種植物有自己的“特殊代謝組”，其由特殊代謝物組成。植物界中至少有391000個這樣的特殊代謝組。我們應(yīng)該發(fā)展分析方法去識別盡可能多的特殊代謝組。MS是獲取全面代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的有力工具。串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）圖提供了有關(guān)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)信息，包括正負(fù)離子模式下m/z值和同位素分布信息。在液相色譜（LC）中，代謝產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)會影響其保留時間；例如，使用普通反相柱進行LC分析時，高極性代謝物保留時間較短，而非極性代謝物保留時間較長，其表明在對代謝物進行歸屬時，盡可能多地考慮到各個數(shù)據(jù)非常重要。

     根據(jù)代謝組學(xué)標(biāo)準(zhǔn)倡議，代謝物的化學(xué)歸屬分為四個級別：1級：鑒定；2級：注釋；3級：表征；4級：未知；數(shù)據(jù)分析方法依此進行�，F(xiàn)有的方法在鑒定“未知”代謝物方面依然存在困難�；�于MS的代謝組學(xué)當(dāng)前的挑戰(zhàn)之一是開發(fā)歸屬未知代謝物的方法。核磁共振（NMR）能夠成功地進行結(jié)構(gòu)鑒定，是因為NMR提供了代謝物的多面或多維譜；而在基于MS的代謝組學(xué)中，LC-MS/MS采集的質(zhì)譜圖也能提供有用的代謝物結(jié)構(gòu)信息。

在此，回顧了LC-MS/MS分析中使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記測定未知代謝物的先新方法。這類方法中，使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的原子會導(dǎo)致目標(biāo)化合物離子m/z值的偏移。這種偏移有助于確定化合物包含的原子數(shù)以及其他特性。

一、將結(jié)構(gòu)異構(gòu)體或類似物化學(xué)歸屬為“表征”

在1級“鑒定”層次中，樣品中檢測到的化合物的LC-MS/MS特征被與真實標(biāo)準(zhǔn)化合物（包括分離代謝物或合成產(chǎn)物）的LC-MS/MS特征進行匹配。在基于MS的代謝組學(xué)中，將樣品與標(biāo)準(zhǔn)品共洗脫是先準(zhǔn)確的化學(xué)歸屬方法。由于可得的標(biāo)準(zhǔn)品有限，研究人員也會使用共享數(shù)據(jù)庫中的LC-MS/MS數(shù)據(jù)或MS/MS數(shù)據(jù)進行研究。在2級“注釋”層次中，樣品中采集到的MS/MS譜被與數(shù)據(jù)庫譜圖進行比較。然而，由于特殊代謝物的化學(xué)多樣性，即使使用了標(biāo)準(zhǔn)化合物和數(shù)據(jù)庫比對，鑒定和注釋所覆蓋的代謝物也僅僅少于5%。在3級“表征”層次中，通過對化合物MS/MS特征解析，以推測代謝物或代謝物含有的官能團。比如，植物通過生物反應(yīng)會產(chǎn)生結(jié)構(gòu)異構(gòu)體和類似物，同分異構(gòu)體中具有相同骨架和官能團的部分會得到相似的MS/MS圖，而類似物結(jié)構(gòu)中修飾部分的質(zhì)譜圖會稍顯不同。需要注意的是，這些異構(gòu)體和類似物結(jié)構(gòu)類似，但通常具有明顯不同的生物學(xué)功能。他們的MS/MS譜的相似處可用于分析檢測到的代謝物異構(gòu)體和類似物之間的關(guān)聯(lián)（圖1）。利用這種相似性能**發(fā)現(xiàn)新的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體/類似物，在已有研究中能增加約40%化合物化學(xué)歸屬。

圖1 表征-化學(xué)歸屬結(jié)構(gòu)異構(gòu)體/類似物

未知代謝物亟需更深入的研究方法

“表征”方法的發(fā)展使挖掘更多的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體/特殊代謝物的類似物成為可能。對于鑒定目標(biāo)代謝物的未知異構(gòu)體/類似物的研究人員來說，比對MS/MS的相似性是一個重要的步驟。一旦核心代謝物的MS/MS被更新到共享數(shù)據(jù)庫中，其未知的異構(gòu)體/類似物可能通過MS/MS的相似性與其產(chǎn)生關(guān)聯(lián)。在植物界，可能還有特殊代謝物具有未被揭示的骨架結(jié)構(gòu)。為了促進這類代謝物的歸屬，亟待更深入的方法。先要做的即是開發(fā)用于從代謝組數(shù)據(jù)中排除已鑒定、注釋和表征的代謝物的方法。

穩(wěn)定同位素標(biāo)記譜圖可作為另一維數(shù)據(jù)

準(zhǔn)確的質(zhì)量分析是確定分子式的關(guān)鍵。目前，質(zhì)譜儀準(zhǔn)確度有了**提高，使得質(zhì)量準(zhǔn)確度可達0.1mDa；但是要確定未知代謝物的分子式，僅靠準(zhǔn)確度是不夠的。在m/z不超過1500的小分子中，至少會有幾個候選分子式。在超高分辨率分析中，**分子量和同位素峰簇同時被用于確定分子式。在中分辨分析（如使用四極桿飛行時間質(zhì)譜）中，同位素峰簇因為沒有被分離而難以被利用。這些事實表明，在中分辨分析中還需要其他的定性條件。

穩(wěn)定同位素標(biāo)記被用于闡明生物化學(xué)和天然產(chǎn)物化學(xué)中的結(jié)構(gòu)。生物體可以從含有穩(wěn)定同位素標(biāo)記的中間體獲得部分或全部標(biāo)記的代謝物。NMR分析對比標(biāo)記代謝物的譜圖和非標(biāo)記代謝物的譜圖可以準(zhǔn)確地進行結(jié)構(gòu)解析。例如，在13C NMR中，非標(biāo)記代謝物的化學(xué)位移和13C標(biāo)記代謝物的耦合常數(shù)代表碳鏈的連接方式。

由于穩(wěn)定同位素對生物體內(nèi)特定代謝物的產(chǎn)生沒有**影響，同位素標(biāo)記可應(yīng)用于基于MS的植物代謝組學(xué)。例如，13CO2被廣泛用來標(biāo)記植物，然后比較未標(biāo)記和標(biāo)記的質(zhì)譜圖，以確定m/z值的變化（圖2）。根據(jù)一級或MS/MS的分析結(jié)果計算確定每個原子的數(shù)量。利用得到的原子數(shù)，結(jié)合質(zhì)量精度和同位素峰簇，可以從一系列可能的候選分子中歸屬得到代謝物的分子式。對于擬南芥樣品，使用13C、15N和34S標(biāo)記得到的代謝物的質(zhì)譜圖分析，可以明確代謝物的分子式。

圖2 使用LC–MS/MS和穩(wěn)定同位素標(biāo)記的代謝組學(xué)示例。

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