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一、概述

His-Tag 蛋白純化磁珠（Magarose-IDA/NTA/TED）針對(duì)純化 His 標(biāo)簽蛋白而研制的一種新型純化介質(zhì)，具有**、快速、方便等特點(diǎn)，可通過磁分離方式直接從生物樣品中一步純化出高純度的目標(biāo)蛋白，**地簡(jiǎn)化純化工藝和提高純化效率，適合科研和工業(yè)領(lǐng)域便捷地進(jìn)行 His-tag 蛋白的純化。對(duì)比傳統(tǒng)的過柱層析純化方式， Magarose NTA磁珠通過磁性分離方式純化組氨酸標(biāo)簽蛋白，無需對(duì)粗蛋白樣品進(jìn)行多次費(fèi)時(shí)費(fèi)力的離心、過濾步驟，無需裝柱和過柱層析，無需昂貴的柱層析設(shè)備，在1小時(shí)內(nèi)便能便捷地獲得高產(chǎn)量和高純度的目的蛋白，且能輕松實(shí)現(xiàn)多樣品平行處理，**提高了工作效率，大大降低了設(shè)備、時(shí)間和人工成本。

本產(chǎn)品系列包括鎳離子（Nickel）和鈷離子（Cobalt）兩種金屬離子螯合磁珠。它們?cè)谀繕?biāo)蛋白結(jié)合量及所得目標(biāo)蛋白純度上有所差異，一般推薦客戶使用鎳離子螯合磁珠，大多數(shù)情況下能滿足客戶對(duì)蛋白載量和純度的要求；對(duì)純度要求更高的客戶推薦使用鈷離子螯合磁珠。

His-Tag 蛋白純化磁珠（Magarose-IDA/NTA/TED）磁珠廣泛適用于細(xì)菌、酵母、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等分泌或胞內(nèi)表達(dá)的可溶性組氨酸標(biāo)簽蛋白以及變性蛋白的純化。

二、產(chǎn)品特性

注：IDA結(jié)合容量高，耐螯合劑差；NTA結(jié)合容量較高，耐螯合劑較好；TED結(jié)合容量低，耐螯合劑**。

三、使用方法

1. 推薦的緩沖液
2. 可溶性組氨酸標(biāo)簽蛋白純化所需緩沖液及配方

Binding Buffer: 20mM PBS, 500mM NaCl, 5~20mM咪唑, pH7.4;

Wash Buffer: 20mM PBS, 500mM NaCl, 20~100mM咪唑, pH7.4;

Elution Buffer: 20mM PBS, 500mM NaCl, 300-500mM咪唑, pH7.4;

1. 包涵體組氨酸標(biāo)簽蛋白純化所需緩沖液及配方

Binding Buffer: 8M Urea, 50mM NaH₂PO₄, 100mM Tris·HCl, pH8.0;

Wash Buffer: 8M Urea, 50 mM NaH₂PO₄, 100 mM Tris·HCl, pH6.3;

Elution Buffer: 8 M Urea, 50 mM NaH₂PO₄, 100mM Tris·HCl, 300-500 mM 咪唑, pH4.5;

Note: Buffer 在使用前需用 0.22 或者 0.45 μm 濾膜過濾除菌。推薦的 Buffer 體系適用于多數(shù)組氨酸標(biāo)簽蛋白的純化，在 Binding Buffer 中添加一定濃度的咪唑可降低非特異性結(jié)合，提高目的蛋白的純度。初次使用的客戶可以采用推薦的緩沖液，再根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果適當(dāng)調(diào)整緩沖液中的咪唑濃度。

2. 樣品準(zhǔn)備

2.1組氨酸標(biāo)簽蛋白樣品準(zhǔn)備（在大腸桿菌下非變性條件下可溶性表達(dá)）

稀釋重組表達(dá)的蛋白：每克大腸桿菌菌體加入5~10 ml binding buffer重懸。樣品和binding buffer含同樣濃度的咪唑可避免宿主細(xì)胞表達(dá)的含組氨酸的蛋白。同時(shí)要去除大顆粒和高濃度的螯合劑，如EDTA，組氨酸、檸檬酸等雜質(zhì)，防止破壞Ni-NTA樹脂。

1. 酶解：0.2 mg/ml 溶菌酶，20 μg/ml DNase，1 mM MgCl₂，1 mM PMSF（終濃度）或其他蛋白酶**劑。加入的**劑必須對(duì)磁珠無影響，4°C混勻30分鐘。
2. 機(jī)械裂解：超聲，均質(zhì)，反復(fù)凍融等。
3. 調(diào)整裂解液的pH到7.4：不要用強(qiáng)堿或酸調(diào)節(jié)pH（防止沉淀）。
4. 裂解液離心：將液體轉(zhuǎn)移到離心管中在室溫或4°C 12000 rpm離心20 min，溫度的選擇取決于蛋白穩(wěn)定性。
5. 收集上清準(zhǔn)備進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，或是收集離心后的沉淀準(zhǔn)備下一步實(shí)驗(yàn)。
6. 對(duì)于在酵母、昆蟲及哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)的蛋白，如果有大量的上清液可以用硫酸銨進(jìn)行蛋白沉淀。用1X PBS透析，加入到磁珠中，如果樣品中不含EDTA，組氨酸，檸檬酸等影響磁珠的成分，可直接上柱。

2.2組氨酸標(biāo)簽蛋白樣品準(zhǔn)備（在大腸桿菌中包涵體表達(dá)變性條件純化）

1. 用1×PBS懸浮細(xì)胞（每ml細(xì)菌沉淀約5 ml 1× PBS），按照上面的超聲條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
2. 裂解液在12,000 rpm離心10 min收集包涵體。用1×PBS洗滌幾次包涵體。
3. 用Binding/Wash buffer溶解包涵體（每ml包涵體約5 ml Buffer），并在室溫下孵育30~60 min�？赡苄枰�均質(zhì)或超聲將沉淀完全溶解。
4. 12,000 rpm離心30 min去除剩余的不溶物。小心的將上清轉(zhuǎn)移到干凈的管中而不觸碰下面的沉淀。

2.3組氨酸標(biāo)簽蛋白純化步驟

磁珠的使用量由用戶根據(jù)目標(biāo)蛋白產(chǎn)量和磁珠載量信息計(jì)算獲得，這里以獲得 5-10mg目標(biāo)蛋白為例：

1. 磁珠準(zhǔn)備：將Ni-NTA磁珠充分混勻，使用移液器取2 ml 的磁珠懸浮液，（磁珠沉降體積500μl）置于離心管中，磁分離，待溶液澄清，吸棄清液，加入ddH₂O反復(fù)清洗，去除酒精。
2. 磁珠平衡：加入5 ml Binding Buffer，反復(fù)吹打5-10次，磁分離，待溶液澄清，吸棄清液，重復(fù)洗2次。
3. 磁珠與目的蛋白結(jié)合：用10 ml Binding Buffer懸浮2 g濕重菌體，進(jìn)行破損和裂解后，即為目的蛋白粗樣，將粗蛋白破碎液加入磁珠，顛倒混勻。室溫孵育15 min（如目標(biāo)蛋白不穩(wěn)定，置于2-8°C下孵育30 min）。
4. 洗雜：置離心管于磁分離器，待溶液澄清，移出上清液，保留以備取樣檢測(cè)。向離心管中加入10 ml Wash Buffer，反復(fù)吹打5-10次，磁分離，待溶液澄清，吸取上清液，保留以備檢測(cè)。重復(fù)洗雜步驟3次以上。
5. 洗脫：用戶可根據(jù)需要改變洗脫體積調(diào)整目標(biāo)蛋白濃度，加入2-10 ml Elution Buffer 加入到離心管中，重懸磁珠混勻，磁分離，待溶液澄清，吸取上清液，即為目的蛋白組分。重復(fù)上述步驟多次，分別收集洗脫組分并留樣檢測(cè)，以提高目的蛋白的回收量。
6. 磁珠后處理：加入5 ml Elution Buffer，重懸磁珠，磁分離，吸棄上清，重復(fù)該步驟2次。再用5 ml ddH₂O反復(fù)清洗3-5次。最后，加入2 ml 20%的乙醇溶液，使總體積等于初始磁珠懸浮液的體積，保存于2-8°C。
7. SDS-PAGE檢測(cè)：純化所得樣品用SDS-PAGE 檢測(cè)。
8. 磁珠再生：磁珠連續(xù)使用三次以上，其結(jié)合目標(biāo)蛋白的能力可能會(huì)明顯降低，建議進(jìn)行磁珠再生處理。

Stripping Buffer: 20 mM Sodium Phosphate, 500 mM NaCl, 100 mM EDTA, pH 7.4

Washing Buffer（可選）: 0.5 M NaOH, 2 M NaCl

Recharge Buffer: 100 mM NiSO₄（該化學(xué)試劑有一定的毒性，可能造成過敏反應(yīng)，使用時(shí)務(wù)必注意）以5 mL 10%（v/v）磁珠懸液為例，詳細(xì)說明磁珠再生操作：

1)        將磁珠懸液磁分離，去除上清，在離心管中加入5 mL ddH₂O，重懸磁珠，磁分離去除上清液。

2)        加入5 mL Stripping Buffer，重懸磁珠，室溫混旋5 min，磁分離，去除上清液。重復(fù)此步驟1次。

3)        加入5 mL ddH₂O，重懸磁珠，磁分離去除上清液，重復(fù)此步驟 2次。

4)        堿處理：加入5 mL Washing Buffer，重懸磁珠，室溫旋轉(zhuǎn)混合5 min，磁分離，去除上清液。加入5 mL ddH₂O，重懸磁珠，磁分離，去除上清液。重復(fù) ddH₂O洗滌步驟3~5次，至洗滌液呈中性。

5)        加入5 mL Recharge Buffer，重懸磁珠，室溫旋轉(zhuǎn)混合20 min，磁性離，去除上清液。

6)        加入5 mL ddH2O，重懸磁珠，磁性離，去除上清液。重復(fù)此步驟4次以上，保證鎳離子去除完全。

7)        加入2ml 20%的乙醇溶液，使總體積等于初始磁珠懸浮液的體積，保存于2-8°C。

3．注意事項(xiàng)

1)         磁珠使用和保存過程中應(yīng)避免冷凍、干燥和高速離心等操作；

2)         使用產(chǎn)品前務(wù)必充分振蕩使磁珠均勻懸��；

3)         磁珠與溶液混合過程中，如果溶液粘稠無法通過翻轉(zhuǎn)離心管重懸磁珠，可采用移液器反復(fù)吹吸或短時(shí)漩渦混合使磁珠充分重懸；

4)         用戶可根據(jù)實(shí)際需要保留經(jīng)磁性分離移去的上清液，進(jìn)行取樣檢測(cè)，以便分析純化過程和優(yōu)化蛋白純化流程；

5)         本產(chǎn)品重復(fù)使用時(shí)建議純化同種蛋白，純化不同蛋白時(shí)，建議使用新的磁珠，以防交叉污染；

6)        本產(chǎn)品需與磁性分離器配套使用；

7)        本試劑盒僅用于體外實(shí)驗(yàn)，不能夠用于臨床、**和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)等，由此產(chǎn)生的后果概不承擔(dān)責(zé)任。