pg電子官方生物--外泌體制備技術(shù)及其儲存方式詳解

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外泌體制備技術(shù)指南：

一、貼壁/懸浮細胞（收集細胞上清，除去細胞或細胞碎片）

（1）貼壁細胞培養(yǎng)誘導結(jié)束后，去除培養(yǎng)液;

（2）加入適量的PBS緩沖液沖洗-次,徹底去除FBS;

（3）按每10cm皿(約107細胞) 10m|培養(yǎng)基,換外泌體專用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)至少48hr (細胞融合率

至少70%以上) ;

（4）48hr后，收集細胞上清，并于3000x g離心15min,去除細胞或細胞碎片;

（5）放入-80°C冰箱中保存。

二、提前做好血清或者血漿的分離

（1）全血:通過采血管采集后，經(jīng)過抗凝處理的全部血液。

（2）血漿:經(jīng)過抗凝處理的全血，進行低速離心后的上清液，為淡黃色液體。

（3）血清:不經(jīng)過抗凝處理的血液，讓它自行凝固，在進行低速離心后的上清液，為淡黃色液體。

不同樣本提取的外泌體比照圖：

血漿樣本圖         血漿提取后的外泌體

全血樣本-已溶血狀態(tài)       溶血后提取的外泌體

具體全血樣本操作如下:

三、組織液（尿液、腦脊液、外泌體）收集處理

尿液：

（1）收集尿液時，應該盡量選擇受試者的“新鮮”尿液20ml,并注意避免細菌污染,收集前注意對飲食的控制;

（2）并于3000x g離心15min,去除細胞或細胞碎片; .

（3） -80°C冰箱中保存;

（4）填寫樣本登記單,記錄樣本名稱、組織類型、編號、取樣日期、樣本處理過程等情況。

腦脊液：

（1）收集集腦脊液10ml,避免受到血液污染;

（2）并于3000xg離心15min,去除細胞或細胞碎片;

（3）-80°C冰箱中保存;

（4）填寫樣本登記單,記錄樣本名稱、組織類型、編號、取樣日期、樣本處理過程等情況。

外泌體：

（1）收集細胞上清或組織液10ml (血清1ml)，抽提外泌體后，用100μL- 500μLBuffer重懸沉淀(所用buffer根據(jù)下游的蛋白分析則用蛋白裂解液，RNA分析則TriZo|裂解) ;

（2）檢測濃度,蛋白濃度2 1ug/ul, RNA濃度250ng/ul;

（3）放入-80°C冰箱中保存。

包裝注意事項：

1.在包裹樣本的鋁箔或冷凍保存管表面，用油性記號筆標明樣本編號及樣本類型。避免被乙醇等有機溶劑抹掉。

2.請用鋁箔或冷凍保存管包裹樣本后再裝入樣本袋中，避免使用紗布、紙張直接包裹樣本。

3.標簽紙請貼于樣本袋繩上，避免貼于容器表面導致脫落造成樣本混亂。

儲存注意事項：

1.樣本采集后,樣本迅速放入進口**凍存管中，擰緊后立即到-80°C中保存。

2.細胞上清樣本處理后儲存于-80°C冰箱中。在20°C冰箱中儲存不宜太久。

3.血液樣本建議使用PAXgene管(BD) 保存。

4. RNA/蛋白樣本儲存于-80°C冰箱中。

運輸方式：干冰與冰袋運輸。

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