SMCC交聯(lián)劑偶聯(lián)載體蛋白KLH和多肽過程

蛋白質(zhì)交聯(lián)劑是一類小分子化合物，具有2個或者更多的針對特殊基團（-NH2、-COOH、-HS等）的反應(yīng)性末端，可以和2個或者更多的分子分別偶聯(lián)，從而使這些分子結(jié)合在一起，然后形成共軛蛋白。

產(chǎn)品名稱：SMCC

簡介：SMCC crosslinker (Succinimidyl-4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate) is a heterobi-functional protein crosslinker with a maleimide group that is sulfhydryl (thiol; -SH) reactive and a NHS ester group that is amine reactive. The SMCC crosslinking reagent is permeable across the lipid bilayer of the cell membrane. The 9 atom spacer arm of SMCC is not cleavable.

Molecular Weight: 334.3

CAS #: 64987-85-5

Spacer Length: 8.3 ?

Alternative Names: 4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexanecarboxylic acid N-hydroxysuccinimide ester;

產(chǎn)品名稱：Sulfo-SMCC

Sulfo-SMCC crosslinker (Sulfosuccinimidyl-4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate) is a water soluble, heterobifunctional crosslinker. Sulfo-SMCC crosslinking reagent has an 8.3 angstrom non-cleavable spacer arm and its maleimide group reacts with sulfhydryls (thiols), while the Sulfo-NHS ester is reactive toward primary amines. Sulfo-SMCC can be used to pro-duce antibody-protein crosslinked conjugates or efficiently label cell surface proteins.

Molecular Weight: 436.4

CAS #: 92921-24-9

Spacer Length: 8.3 ?

SMCC是一類含有N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活性酯和馬來酰亞胺的雙功能偶聯(lián)劑.可以將分別含有巰基和氨基的化合物鍵接在一起。該交聯(lián)試劑可滲透到細胞膜的脂質(zhì)雙層中，NHS活性酯與伯胺在PH7-9的環(huán)境形成酰胺鍵。馬來酰胺與巰基在PH6.5-7.5的環(huán)境下形成穩(wěn)定的硫醚鍵。在水溶液中，NHS活性酯的水解是（與氨基的反應(yīng)）個競爭反應(yīng)。馬來酰胺比NHS穩(wěn)定，但是在PH大于7.5時，馬來酰胺會慢慢水解，失去與巰基反應(yīng)的特異性。因而，在使用SMCC時通常是在PH7.2-7.5的環(huán)境下進行，并且先讓NHS發(fā)生反應(yīng)。

SMCC結(jié)構(gòu)里的環(huán)己烷環(huán)可以降低馬來酰胺的水解速率。這使得蛋白質(zhì)在用SMCC修飾之后可以凍干存放一段時間。很多蛋白質(zhì)都選用該試劑來進行馬來酰亞胺修飾。

KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin)，即血藍蛋白，是在某些軟體動物、節(jié)肢動物(蜘蛛和甲殼蟲)的血淋巴中發(fā)現(xiàn)的一種游離的藍色呼吸色素。血藍蛋白含兩個直接連接多肽鏈的銅離子，與含鐵的血紅蛋白類似，它易于氧結(jié)合，也易與氧解離，是已知的惟一可與氧可逆結(jié)合的銅蛋白，氧化時呈青綠色，還原時呈白色。其分子量45０ ０00～１30 000。由于KLH比BSA有更高的免疫原性，因而是常被選用的載體蛋白。

用SMCC來制備抗體-酶或者半抗原作載體的蛋白質(zhì)，經(jīng)常采用兩步合成法。步驟一，含有氨基的蛋白質(zhì)與幾倍的偶聯(lián)劑反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后通過脫鹽柱或者透析的方法除掉沒有反應(yīng)完的SMCC。然后，再與含有巰基的蛋白質(zhì)反應(yīng)。在實際操作中要注意的是，SMCC怕潮濕，存放時要和干燥劑一起存放。并且使用中從冰箱拿出來時要先在室外放置一段時間平衡溫度，以免立刻開啟，空氣中水分遇冷凝結(jié)，破壞SMCC 結(jié)構(gòu)。

1、 將 20 mg SMCC（這是聯(lián)接40條多肽的量）溶于2 ml DMF。

2、 將0.8 ml KLH加入到25 ml圓底燒瓶中，補加1×PBS(pH 7.2)使蛋白終濃度為 15 mg/ml。

3、 將溶解好的SMCC溶液緩慢滴加到120 mg KLH 蛋白體系中，室溫攪拌反應(yīng)1h。

4、 用1 L 1×PBS (PH 7.4) 溶液于4℃下透析 6 小時，除去游離的SMCC。

5、 將透析后的KLH蛋白倒入50 ml離心管中，通過離心管的刻度確定其體積，根據(jù)反應(yīng)前加入的KLH蛋白的量來計算透析后蛋白的濃度，然后根據(jù)其濃度將2.5 mg KLH-SMCC溶液轉(zhuǎn)移到5 ml離心管中。
例如：反應(yīng)前加入KLH蛋白的量為120 mg，透析后的KLH蛋白體積為20 ml，那么透析后的KLH蛋白濃                                                      μl KLH-SMCC溶液轉(zhuǎn)移到5 ml離心管中。

6、 將 3.0 mg 多肽用 0.6 ml 1×PBS (pH 7.2) 溶液溶解。
注意：這里多稱量出0.5 mg多肽是用來做ELISA檢測的，取出100 μl即可。檢測多肽隨交聯(lián)好的抗原一起寄出，濃度為5 mg/ml。

7、 用Ellman試劑檢測多肽中的巰基：在96孔板中加入100 μl Ellman試劑儲備液，再加入10μl多肽溶液，用Nano分光光度計在λ=412 nm下測其紫外吸收值，如果OD值>0.15做 下一步；OD值<0.15并>0.05補加多肽，直至達到要求；OD值<0.05返回多肽合成步驟重新質(zhì)控。
Ellman試劑是用來檢測游離巰基的，如果檢測液顯黃色說明多肽的Cys的巰基大部分以游離態(tài)存在；如果檢測液不顯黃色則說明多肽Cys中的巰基已經(jīng)被氧化形成二聚體或多聚體。

8、 將多肽液滴加到KLH-SMCC管中，室溫下用垂直混勻器混勻反應(yīng)4小時。

9、 用Ellman試劑檢測多肽中的巰基：在96孔板中加入100 μl Ellman試劑儲備液，再加入10 μl 教練后的多肽溶液，用Nano分光光度計在λ=412 nm下測定紫外吸收值。OD值<0.03說明多肽和KLH蛋白交聯(lián)率已達到80%以上；OD值>0.03則再補加SMCC活化好的KLH蛋白繼續(xù)交聯(lián)。如果Ellman試劑顯黃色說明多肽與KLH蛋白偶聯(lián)不完全；如果Ellman試劑不顯黃色則說明多肽已經(jīng)全部與KLH蛋白偶聯(lián)。

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（一））：生物素交聯(lián)試劑

Biotinylation Reagents生物素化試劑

Sulfo-NHS-Biotin     CAS Number: 119616-38-5

NHS-Biotin          CAS Number: 35013-72-0

Sulfo-NHS-LC-Biotin  CAS Number: 127062-22-0

NHS-LC-Biotin       CAS Number: 72040-63-2

Sulfo-NHS-SS-Biotin  CAS Number: 325143-98-4

NHS-SS-Biotin       CAS Number: 142439-92-7

Biotin Hydrazide      CAS Number: 66640-86-6

Biotin-HPDP         CAS Number: 129179-83-5

Iodoacetyl-LC-Biotin   CAS Number: 93285-75-7

（二）Heterobifunctional Crosslinkers異型雙功能交聯(lián)劑：

SMCC Crosslinker           CAS Number: 64987-85-5

Sulfo-SMCC Crosslinker      CAS Number: 92921-24-9

Sulfo-SANPAH Crosslinker    CAS Number: 102568-43-4

SMPH Crosslinker

PDPH Crosslinker

MBS Crosslinker             CAS Number: 58626-38-3

Sulfo-MBS Crosslinker

SPDP Crosslinker            CAS Number: 68181-17-9

LC-SPDP Crosslinker  

Sulfo-LC-SPDP Crosslinker

SIA Crosslinker              CAS Number: 39028-27-8

SBA Crosslinker             CAS Number: 42014-51-7

SMPB Crosslinker           CAS Number: 79886-55-8

BMPS Crosslinker           CAS Number: 55750-62-4

EMCS Crosslinker           CAS Number: 55750-63-5

GMBS Crosslinker          CAS Number: 80307-12-6

ANB-NOS Crosslinker        CAS Number: 60117-35-3

Homobifunctional Crosslinkers同型雙功能交聯(lián)劑：

BS3 Crosslinker           CAS Number: 82436-77-9

DSS Crosslinker           CAS Number: 68528-80-3

BS2G Crosslinker

DSG Crosslinker          CAS Number: 79642-50-5

DSP Crosslinker           CAS Number: 57757-57-0

DTSSP Crosslinker        CAS Number: 81069-02-5

Sulfo-EGS Crosslinker     CAS Number: 167410-92-6

EGS Crosslinker          CAS Number: 70539-42-3

DST Crosslinker          CAS Number: 62069-75-4

Zero-Length Crosslinkers - EDC-HCl, Sulfo-NHS & NHS：

EDC-HCl               CAS Number: 25952-53-8

Sulfo-NHS              CAS Number: 106627-54-7

Deuterated Crosslinker BS3-d4

Deuterated Crosslinker BS2G-d4

Deuterated Crosslinker DSS-d4

（三）：Protein modification regents （蛋白修飾相關(guān)試劑）

Protein Modification Reagents 蛋白質(zhì)修飾劑：

SATA Protein Modifier

N-Succinimidyl-S-Acetyl-Thioacetate

CAS Number: 76931-93-6

Sulfo-NHS-Acetate

CAS Number: 152305-87-8

Traut's Reagent  

CAS Number: 4781-83-3

HPG

CAS Number: 24645-80-5

Iodoacetic Acid

CAS Number: 64-69-7

BMPA Modifier

CAS Number: 7423-55-4

（四）Immobilization Resins固定化樹脂

Immobilization Resins固定化樹脂

Amino-Reactive Resin

Sulfhydryl-Reactive Resin

Carbohydrate-Reactive Resin

Carboxyl-Reactive Resin

Immobilized Pepsin  

Immobilized Chymotrypsin

【交聯(lián)劑的應(yīng)用】：

細胞膜結(jié)構(gòu)研究

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究

蛋白質(zhì)間相互作用研究

生物研究（靶向**）

載體蛋白與半抗原的連接

蛋白質(zhì)或其他分子的固相化

抗體的標記、標記轉(zhuǎn)移

蛋白質(zhì)與核酸的連接

蛋白質(zhì)修飾等 

【選擇交聯(lián)劑應(yīng)考慮的因素】：

反應(yīng)特異性

反應(yīng)指向性

間臂長度性

水溶性

透膜性

一種或兩種反應(yīng)基團

熱反應(yīng)還是光電反應(yīng)

可否切斷

可否碘標

【可與交聯(lián)劑反應(yīng)的基團】：

游離氨基（賴氨酸ε或N末端的氨基）

巰基（半胱氨酸）

羧基（天冬氨酸，谷氨酸，末端羧基）

羥基（絲氨酸或蘇氨酸）

酮基，醛基，糖鏈

苯酚衍生物（苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸）

放射性基團: R-N3 

以上來自小編zhn2020.10.30