用熒光探針對(duì)特定的靶蛋白（POI）進(jìn)行標(biāo)記已經(jīng)成為研究蛋白表達(dá)、定位和轉(zhuǎn)運(yùn)的主要方式之一。然而，用于標(biāo)記的熒光探針多數(shù)是“always-on”型的，這限制了其廣泛應(yīng)用。因此，設(shè)計(jì)合成”turn-on”型熒光探針用于特定蛋白的標(biāo)記已成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。

近日，加拿大渥太華大學(xué)的Jeffrey W. Keillor教授課題組設(shè)計(jì)合成了雙馬來(lái)酰亞胺熒光團(tuán)4（又名YC23），該分子以氟硼二吡咯（BODIPY）為基本骨架，連接上雙馬來(lái)酰亞胺后，其光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET）的特性致使BODIPY發(fā)生熒光淬滅。只有當(dāng)特定蛋白的巰基與馬來(lái)酰亞胺發(fā)生加成反應(yīng)后，BODIPY的熒光才能恢復(fù)（圖1）。作者還將該分子應(yīng)用于細(xì)胞裂解液和哺乳動(dòng)物中特定蛋白的熒光標(biāo)記。相關(guān)成果以“A green BODIPY-based, super-fluorogenic, protein-specific labelling agent”為題發(fā)表在Angew. Chem. Int. Ed.上（DOI: 10.1002/anie.201805482）。

作者選擇了麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）作為測(cè)試蛋白，并將可遺傳編碼的肽標(biāo)簽dC10α標(biāo)記在C末端得到MBP-dC10α。接著，作者對(duì)MBP-dC10α與YC23的反應(yīng)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：在與測(cè)試蛋白反應(yīng)之前， YC23顯示出可忽略的背景熒光（圖2，x軸上的黑線）。隨著MBP-dC10α加入量的增加，YC23的熒光強(qiáng)度**增加（圖2）。

隨后，作者對(duì)25 ?M MBP-dC10α與25 ?M YC23反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行評(píng)估，探究其兩次加成反應(yīng)所擬合的函數(shù)模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其主要與二階模型相匹配，速率常數(shù)為868±118 M^-1min^-1（圖3）。

圖3. 定量YC23與定量MBP-dC10α反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的擬合圖

接下來(lái)，為了探究MBP-dC10α與YC23結(jié)合的選擇性，作者在細(xì)菌裂解液中用YC23標(biāo)記MBP-dC10α，并將溫度升至95 ℃且維持15 min，再進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析。結(jié)果顯示，被標(biāo)記的測(cè)試蛋白始終保持其明亮的熒光，甚至在變性條件下也能如此（圖4B）。在細(xì)胞裂解液的復(fù)雜生物混合物中，低至10 μM的YC23足以可視地標(biāo)記測(cè)試蛋白。圖4A與4B的比較結(jié)果揭示了YC23標(biāo)記的選擇性，只有目標(biāo)蛋白被明確標(biāo)記并發(fā)出強(qiáng)烈的熒光。

圖4. MBP-dC10α與YC23結(jié)合的選擇性分析

在細(xì)菌裂解液中探究了YC23的選擇性后，作者又研究了其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的相關(guān)特性。作者選擇了只存在于細(xì)胞核中的組蛋白H2B為特定蛋白，并將dC10α標(biāo)記在它的C末端，隨后，用能表達(dá)相關(guān)蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，將YC23與Hela細(xì)胞共同孵育。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，YC23的熒光只存在于細(xì)胞核中，證明了其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有較好的選擇性（圖5）。

圖5. Hela細(xì)胞的蛋白標(biāo)記成像

總結(jié)：作者開(kāi)發(fā)了一種用于蛋白標(biāo)記的新型雙馬來(lái)酰亞胺BODIPY熒光探針，在細(xì)菌裂解液和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中均能標(biāo)記特定的蛋白，且具有較高的選擇性和穩(wěn)定性，這對(duì)于探究蛋白的表達(dá)、定位和轉(zhuǎn)運(yùn)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。