在光的照射下，某些物質(zhì)吸收光進(jìn)入刺激狀態(tài)。當(dāng)從刺激狀態(tài)回到基態(tài)時(shí)，吸收的光能可以以電磁輻射的形式釋放。這種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光。在這種現(xiàn)象中，如果用短波長(zhǎng)光照射物質(zhì)，它可以在很短的時(shí)間內(nèi)發(fā)出比照射光長(zhǎng)的波長(zhǎng)光，即熒光。熒光素是一些具有這種特性的染料。20世紀(jì)40年代，F(xiàn)ITC異硫氰酸熒光素標(biāo)記抗體檢測(cè)可溶性肺炎球菌多糖抗原并取得成功。從那時(shí)起，創(chuàng)建了免疫熒光抗體標(biāo)記技術(shù)。該技術(shù)將抗原抗體反應(yīng)的高特異性與熒光的敏感性和可測(cè)性有機(jī)結(jié)合，可準(zhǔn)確、特異、敏感、快速檢測(cè)和定位未知和微量抗原。目前，它已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域和學(xué)科。

　　FITC標(biāo)記抗體的原理

　　FITC異硫氰酸熒光素是一種常用的標(biāo)記抗體的方法。FITC一般為黃色。棕色或棕色粉末或結(jié)晶，在低溫下可保存數(shù)年。在堿性條件下，F(xiàn)ITC的碳酰胺鍵可與抗體蛋白上的賴氨酸氨基結(jié)合，形成FITC-蛋白質(zhì)結(jié)合物，即熒光抗體或熒光結(jié)合物�？贵w分子**可標(biāo)記15~20個(gè)FITC分子。標(biāo)記的抗體仍能保持與相應(yīng)抗原結(jié)合的能力，在熒光源紫外線或藍(lán)紫光的刺激下產(chǎn)生黃綠色熒光，通過熒光顯微鏡觀察或使用流細(xì)胞儀進(jìn)行分析，從而定性、定位或定量抗原。

　　FITC標(biāo)記抗體方法

　　FITC抗體標(biāo)記主要包括Marshall直接標(biāo)記法.Chadwick間接標(biāo)記法.改進(jìn)標(biāo)記法和透析法。

　　Marshall直接標(biāo)記法

　　抗體準(zhǔn)備:取純化Ig溶液測(cè)量蛋白質(zhì)含量，放入三角燒瓶中，加入生理鹽水和0.5mol/LpH9.5碳酸鹽緩沖液，在冰箱中攪拌5~10min;

　　熒光素準(zhǔn)備：按每毫克蛋白質(zhì)加0.01~0.02mg的FITC計(jì)算，準(zhǔn)確稱為取后加入抗體溶液;

　　標(biāo)記:攪拌時(shí)加入熒光素，避免粉末粘附在墻上，放入4℃冰箱或冰庫(kù)繼續(xù)攪拌12~18h;

　　透析:組合后，將組合物與3000r/min離心20min，去除少量沉淀物，放入透析袋中，然后放入pH8.0緩沖鹽燒杯中透析一夜;

　　過柱：取透析過夜標(biāo)記，過葡聚糖凝膠G-25或G-50柱，分離自由FITC，收集標(biāo)記熒光抗體進(jìn)行鑒定。

　　Chadwick間接標(biāo)記法

　　抗體準(zhǔn)備:0~4℃下，用0.01mol/LpH8.0PBS將待標(biāo)記的抗體蛋白溶液稀釋至30~40mg/ml，放入三角燒瓶中放入冰箱;

　　熒光素準(zhǔn)備:按每毫克蛋白質(zhì)加入0.01mg熒光素，溶解在等量3%重碳酸鈉水溶液中;將抗體蛋白溶液等量與FITC溶液混合，在0~4℃攪拌18~24小時(shí)，充分?jǐn)嚢?

　　透析或柱層分析

　　改良法

　　抗體準(zhǔn)備:取純化Ig溶液測(cè)量蛋白質(zhì)含量，放入三角燒瓶中，加入生理鹽水和0.5mol/LPH9.5碳酸鹽緩沖液，在冰箱中攪拌5~10min;

　　熒光素準(zhǔn)備：按每毫克蛋白質(zhì)加0.01~0.02mg的FITC計(jì)算，準(zhǔn)確稱為取后加入抗體溶液;

　　標(biāo)記:攪拌時(shí)加入熒光素，避免粉末粘附在墻上，放入4℃冰箱或冰庫(kù)繼續(xù)攪拌12~18h;

　　用半飽和硫酸銨將標(biāo)記的抗體蛋白沉淀分離，3000r/min離心30min，將上清液中的游離熒光素傾倒，然后用緩沖鹽水透析去除硫酸銨。將準(zhǔn)備好的熒光抗體加入0.01%nan3，分裝保存。

　　透析法

　　用0.025mol/LPH9.2碳酸鹽緩沖液將待標(biāo)記的抗體蛋白稀釋成1%濃度，放入透析袋中;

　　FITC用同樣的緩沖液制成0.1mg/ml溶液，放入圓形容器中，浸泡透析袋，4℃攪拌24h;

　　取出透析袋中的標(biāo)記液。立即通過G-25或G-50柱葡聚糖凝膠，去除游離熒光素，收集熒光抗體進(jìn)行鑒定。

　　熒光抗體質(zhì)量控制

　　FITC熒光標(biāo)記抗體的質(zhì)量鑒定，包括特異性和敏感性鑒定。

　　鑒定染色特異性和敏感性

　　特異性染色效率的測(cè)定:直接染色時(shí)，熒光抗體溶液以1:2.1:4.1:8的比例稀釋，并與相應(yīng)的抗原標(biāo)本進(jìn)行一系列染色。熒光強(qiáng)度在+++的**稀釋度是熒光抗體的染色效率。如果染色效率為1:64，實(shí)際染色時(shí)可采用1:32或1:16。如果是間接染色效率測(cè)定，可以先用不同稀釋度的熒光抗體染色。因此，以抗核抗體熒光強(qiáng)度++為標(biāo)準(zhǔn)

　　非特異性染色：根據(jù)熒光抗體的不同用途，類似的抗原切片或涂片可以稀釋熒光抗體。根據(jù)常規(guī)染色步驟，標(biāo)本上的非特異性染色應(yīng)明顯低于特異性染色滴度，否則熒光抗體應(yīng)通過消除非特異性染色來(lái)處理;

　　吸收試驗(yàn)：在熒光抗體中加入過量的相應(yīng)抗原，在室溫下攪拌2小時(shí)，移入4℃中過夜，3000r/min，離心30min，收集清液，然后用相應(yīng)的抗原陽(yáng)性標(biāo)本染色，結(jié)果不應(yīng)有明顯的陽(yáng)性熒光。

　　F/P值測(cè)定

　　熒光抗體的鑒定一般采用熒光素(F)與抗體蛋白(P)的克分子比，即F/R值，反映熒光抗體的特異性染色質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)要求F/R比為1~2。當(dāng)過高時(shí)，非特異性染色增強(qiáng);當(dāng)熒光太低時(shí)，熒光很弱，以降低敏感性。具體方法如下:

　　蛋白質(zhì)定量：確定熒光抗體的蛋白質(zhì)mg/ml;

　　制作熒光素定量標(biāo)準(zhǔn)曲線：將FITC1mg溶解在10ml0.5mol/lpH9.0碳酸鹽緩沖液中，然后用0.01mol/lpH7.2PBS稀釋到100ml，獲得的熒光素含量為10ug/ml，并將9種不同濃度的溶液不同濃度的溶液。OD值用分光光度計(jì)在490nm波長(zhǎng)中測(cè)量，標(biāo)準(zhǔn)函數(shù)圖以光密度為縱坐標(biāo)，熒光素含量為橫坐標(biāo);

　　結(jié)合熒光素定量：熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合后，其吸收光譜峰值向長(zhǎng)波方向移動(dòng)約5nm，讀取值后可按公式計(jì)算。

　　FITC抗體標(biāo)記注意事項(xiàng)

　　溫度.時(shí)間.pH.熒光素和蛋白質(zhì)量等都是影響標(biāo)記效率的因素，需要控制;

　　熒光素及其標(biāo)記抗體的操作過程應(yīng)注意避光，攪拌速度應(yīng)適當(dāng)避免產(chǎn)生氣泡;

　　注意正確操作，使柱體均勻.柱面平整，無(wú)氣泡.裂縫;

　　上樣和洗脫應(yīng)為前切和后切。前切指柱頂緩沖液與凝膠平面相切時(shí)加樣品，后切指樣品與凝膠平面相切時(shí)加洗脫緩沖液。

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