DAF-FM DA（新一代用于一氧化氮定量檢測(cè)的熒光探針）的使用方法使用方法

一、儲(chǔ)存液制備

2.1   儲(chǔ)存液制備

取低溫保存的凍干粉置于室溫回溫至少20min，低速離心后，加入適量體積的無水DMSO配制成一定濃度的儲(chǔ)存液。比如，往1mg DAF-FM DA（Mw：496.42）加入402.88μl DMSO，充分溶解后配制成5mM儲(chǔ)存液。

2.2   儲(chǔ)存液保存

為了延長(zhǎng)儲(chǔ)存液的保存時(shí)間，需根據(jù)單次用量分裝避光凍存，以最小化反復(fù)凍融次數(shù)。分裝凍存的溶液至少穩(wěn)定保存6個(gè)月。

2.3   工作液制備

于正式實(shí)驗(yàn)前，用合適的生理緩沖液或新鮮培養(yǎng)基取適量?jī)?chǔ)存液稀釋到工作濃度。工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用，多余的工作液需丟棄。建議起始工作濃度范圍是1-10μM。

二、操作步驟

【注意】：以下操作步驟僅做參考。**的加載濃度、時(shí)間和溫度需根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來調(diào)整�？偟膩碚f，以能達(dá)到檢測(cè)需求的**濃度**。通過降低加載溫度能減緩亞細(xì)胞區(qū)室化現(xiàn)象。

2.1 細(xì)胞懸液或玻片上準(zhǔn)備活細(xì)胞；

2.2 用適當(dāng)緩沖液或新鮮培養(yǎng)基（不含血清和酚紅）稀釋DMSO儲(chǔ)存液。建議起始工作濃度范圍是1-10μM。

2.3 用稀釋好的DAF-FM DA工作液孵育細(xì)胞20~60min，孵育溫度為4~37℃。貼壁細(xì)胞不需消化后再加載。

2.4 用PBS, pH 7.4充分清洗細(xì)胞直至去除多余探針。更換新鮮緩沖液或培養(yǎng)基再孵育15~30min，使得細(xì)胞內(nèi)酯酶能將探針充分去酯化。

2.5 激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別是495和515nm。因這些波長(zhǎng)與熒光素（fluorescein）非常相似，因此，適用于熒光素（fluorescein）或FITC的檢測(cè)系統(tǒng)都行。

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小編zhn2021.11.23