DNA作為遺傳信息的攜帶者和基因表達的物質(zhì)基礎(chǔ)，在生物體的生長、發(fā)育、衰老、遺傳和變異等生命過程中起著極為重要的作用。目前測定DNA的分析方法有很多種，其中熒光探針技術(shù)是一種借助高靈敏度光學(xué)檢測設(shè)備在分子水平上進行實時監(jiān)測的重要技術(shù)手段，具有操作簡單、靈敏度高、選擇性好、可視性強、適應(yīng)環(huán)境能力強等特點，在生物學(xué)分析中受到了人們的廣泛關(guān)注和研究。熒光標(biāo)記DNA片段包括熒光標(biāo)記寡核苷酸探針和熒光標(biāo)記長片段DNA探針。近年來，用熒光染料對探針進行非放射性標(biāo)記受到很大重視，并取得了迅速發(fā)展，廣泛應(yīng)用于核酸序列測定、基因檢測以及疾病診斷等。

一、 什么是熒光

當(dāng)紫外光或可見光照射到某些物質(zhì)上的時候，這些物質(zhì)就會發(fā)射出波長和強度各不相同的光線，而當(dāng)紫外光或可見光停止照射時，這種光線也隨之很快地消失，這種光線稱為熒光。

熒光的波長比吸收的紫外線的波長要長些。熒光產(chǎn)生的過程簡單來說，是物質(zhì)在吸收入射光的過程中，光子的能量傳遞給物質(zhì)分子，分子被激發(fā)，處于激發(fā)態(tài)的分子不穩(wěn)定，可通過輻射躍遷的衰變過程而返回基態(tài)，衰變過程伴隨著光子的發(fā)射，即產(chǎn)生熒光。一些能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)可以運用到生物染色劑中，我們稱之為熒光染料（熒光色素）或熒光探針。

二、熒光淬滅

熒光淬滅一般是指熒光分子通過與溶劑或者與之對應(yīng)的溶質(zhì)分子之間的物理或者化學(xué)作用從而降低熒光強度的過程。在這個過程中，發(fā)光分子的基態(tài)壽命會產(chǎn)生一定程度的縮短。

熒光淬滅一般有動態(tài)淬滅和靜態(tài)淬滅兩類。這些能使熒光發(fā)生淬滅的物質(zhì)被稱作熒光淬滅劑，而熒光淬滅使得熒光物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率大幅度降低。熒光淬滅還表現(xiàn)在分子受阻碰撞淬滅，自身能量的消失或者轉(zhuǎn)移，外力阻止的淬滅等。

三、熒光標(biāo)記寡核苷酸的應(yīng)用

熒光標(biāo)記寡核苷酸的應(yīng)用基礎(chǔ)是核酸雜交原理。通過與目標(biāo)核酸分子進行各種形式的雜交反應(yīng)，再采用相關(guān)的熒光探針檢測技術(shù)，對靶DNA或RNA進行分析。在與修飾寡核苷酸應(yīng)用相關(guān)的診斷測試手段中，熒光檢測（如基于熒光探針的qPCR）是**重要的一類技術(shù)。對例如DNA Sanger測序和原位雜交（如FISH）的某些特定應(yīng)用，寡核苷酸需要單一標(biāo)記，而用于DNA/RNA實時熒光定量檢測的探針（熒光基團-淬滅劑探針）和用于等位基因鑒別的探針（分子信標(biāo)），均為雙重標(biāo)記，即使用熒光基團—淬滅劑對，動態(tài)淬滅通過FRET（熒光共振能量轉(zhuǎn)移）或碰撞淬滅發(fā)生。淬滅機制與探針類型有關(guān)，一般來說，要么探針打開，增加熒光基團與淬滅劑之間的距離使淬滅停止（分子信標(biāo)），要么熒光基團或淬滅劑從探針（Taqman探針）上裂解（常見）。

四、熒光基團

1、熒光素標(biāo)記

寡核苷酸標(biāo)記熒光素類染料的方法有多種，且標(biāo)記的選擇多樣化，跟芳香環(huán)的氯化程度有關(guān)——這決定了染料的熒光發(fā)射。衍生自單異構(gòu)體6-羧基熒光素的6-FAM CE Phosphoramidite、6-HEX CE Phosphoramidite和6-TET-CE Phosphoramidite均可用于寡核苷酸5’端的**標(biāo)記。

另外兩種可用于寡核苷酸熒光素標(biāo)記的亞磷酰胺單體：6-Fluorescein-CE Phosphoramidite和Fluorescein-CE Phosphoramidite，這兩種單體都包含與6-FAM CE Phosphoramidite相同的熒光染料，但鏈接骨架不同。6-Fluorescein-CE Phosphoramidite具有1,3二醇結(jié)構(gòu)，其中額外的OH受DMTr保護。這樣不但可以通過DMTr的釋放監(jiān)測偶聯(lián)效率，而且還可以在寡核苷酸中進行多次添加，可用于染色體涂染等。然而，這通常需要在每次添加之間加入一個接頭（例如spacer-18），防止熒光素自淬滅。Fluorescein-CE Phosphoramidite提供了與6-Fluorescein-CE Phosphoramidite相同的可能性，但該種情況下接頭通過硫脲鍵連接至熒光素。

序列內(nèi)部添加熒光素可通過使用Fluorescein-dT-CE Phosphoramidite取代任意適合的dT殘基實現(xiàn)。同樣可以進行多次添加，但每個fluorescein-dT之間的間距對防止自淬滅至關(guān)重要。

寡核苷酸3’端熒光素的標(biāo)記可通過使用四種不同載體實現(xiàn)�；�于取代熒光素5-異構(gòu)體的3’-Fluorescein CPG以及由6-FAM制備的3'-(6-Fluorescein) CPG，通常均用于此目的。此外，還有同樣源自6-羧基熒光素的3'-(6-FAM) CPG和Fluorescein-dT CPG；其中3'-(6-FAM) CPG可以**阻斷聚合酶向3’末端的延伸以及核酸外切酶活性。

2、菁染料Cyanine dyes（包括QuasarTM染料）

菁染料作為熒光標(biāo)記的寡核苷酸主要用于分子診斷中的探針制備，例如real-time PCR、熒光原位雜交（FISH）、以及基于表面增強共振拉曼光譜（SERRS）的DNA檢測。它們的發(fā)射光譜可以通過改變聚甲炔鏈的長度來調(diào)節(jié)，并且可以通過芳環(huán)上的取代基來改變它們在有機或水性溶劑中的溶解度。

常用的亞磷酰胺染料是Cyanine-3 (Cy3 MMTr CE Phosphoramidite)和Cyanine-5 (Cy5 MMTr CE Phosphoramidite)。這些染料通常在合成過程中連接到寡核苷酸的5'端，但也很容易摻入序列中間。羥基保護基MMT的去除方式與DMTr保護基相同。由于結(jié)構(gòu)中缺少雜環(huán)堿基，摻入序列中間并不常見，而且不具備參與堿基配對的能力——會使形成的雙鏈不穩(wěn)定。

對于3'-修飾，可引入等效的3'-修飾1000?CPG載體，3'-Cyanine-3 (3'-Cyanine-3 CPG) 和3'-Cyanine-5 (3'-Cyanine-5 CPG)。

Quasar染料570和670（亞磷酰胺單體）是熒光吲哚羰菁，分別在橙黃色和紅色區(qū)域發(fā)出熒光的可見光譜。這兩種染料在熒光探針標(biāo)記中的應(yīng)用直接同功于常見的菁染料（Cy?），Quasar570類似Cyanine-3/Cy3，Quasar670類似Cyanine-5/Cy5。與Cyanine-3和Cyanine-5不同的是Quasar染料不能在寡核苷酸序列中間添加。

3、CAL FluorTM染料

CAL Fluor染料是一組專門為qPCR儀器設(shè)計的熒光染料。這些新型的呫噸熒光基團可以替代以前的染料，是低成本的替代品。染料可以**制造，并且在寡核苷酸的合成及后處理條件下保持穩(wěn)定。將CAL Fluor染料與生物分子連接的連接化學(xué)消除了多種異構(gòu)體的問題。這使得染料標(biāo)記更易于制備、具有單個RP-HPLC峰并具有明確的發(fā)射光譜。

CAL Fluor染料可以CPG和亞磷酰胺單體的形式提供，發(fā)射波長為520nm至635nm，可與淬滅基團BHQ-1或BHQ-2配對。

4、ROX染料標(biāo)記

ROX熒光染料（羧基-X-羅丹明）通常用作被動參比染料，為熒光報告染料（即多重qPCR或real-time PCR中的SYBR Green I或TaqMan探針）提供穩(wěn)定的基線�；�線還允許校正移液誤差、熒光波動和儀器漂移，例如燈強度輸出隨時間的變化。由于染料不會干擾qPCR擴增，因此將恒定量添加到所有樣品中作為對照。

根據(jù)實驗期間使用的濾光鏡和real-time PCR儀器，可能需要調(diào)整ROX的濃度。早期的real-time PCR儀器沒有匹配ROX的濾光鏡，因此需要高濃度來建立基線。后來的儀器使用內(nèi)標(biāo)解決了這一短板，以校正光強度。由于ROX染料與所有PCR儀器兼容，現(xiàn)在的儀器已針對ROX光譜設(shè)置進行校準(zhǔn)，因此無需重新校準(zhǔn)熱循環(huán)儀。

五、淬滅基團

1、TAMRA標(biāo)記

TAMRA是寡核苷酸的應(yīng)用中常用的羅丹明染料。其熒光特性有時用于寡核苷酸標(biāo)記，但TAMRA更常用作淬滅劑。

TAMRA的光吸收特性以及與幾種常用熒光團（包括FAM、HEX、TET和JOE）的光譜重疊，使其可用作設(shè)計雙標(biāo)探針的淬滅劑。然而，TAMRA的用處有限，因為它的發(fā)射光譜廣，這降低了它在多重檢測中應(yīng)用的能力。其固有熒光產(chǎn)生背景信號，會潛在降低基于TAMRA檢測的靈敏度。盡管存在這些限制，TAMRA已廣泛用于檢測探針的設(shè)計，尤其是用于Real-Time PCR的Taqman探針。

寡核苷酸可以使用兩種不同的方法標(biāo)記TAMRA。TAMRA對強堿不夠穩(wěn)定，且在氫氧化銨存在下降解。如果需要去保護，則在寡核苷酸的3'-（常見）或5'-末端合成氨基，并使用TAMRA-NHS酯進行合成后標(biāo)記TAMRA。使用溫和的去保護單體合成的寡核苷酸可以直接用TAMRA標(biāo)記，或者在序列中間通過用TAMRA-dT-CE Phosphoramidite 取代任何合適的dT殘基，或者在3'-末端使用3'-TAMRA CPG載體。隨后寡核苷酸的脫保護在70℃下使用叔丁胺/甲醇/水（1:1:2）處理2.5小時完成。盡管仍有少量TAMRA降解，但在純化過程中很容易去除。如前所述，TAMRA也是一種熒光基團，雖然是使用廣泛的淬滅劑之一，但應(yīng)用中通常需要使用黑暗淬滅劑（Dark Quencher）。

2、非熒光淬滅劑

2.1 Dabcyl標(biāo)記

Dabcyl由于其吸光特性且無殘留熒光，已被廣泛用作診斷探針（如分子信標(biāo)）中的淬滅劑。在非活性狀態(tài)下，分子信標(biāo)不與靶序列雜交，熒光基團的熒光能量通過碰撞淬滅過程轉(zhuǎn)移至淬滅劑。為了**地進行光能轉(zhuǎn)移，熒光基團和淬滅劑必須非�？拷�。分子信標(biāo)的設(shè)計中考慮了這一要求，因為莖的兩部分雜交以保持F/Q非�？拷�的距離。分子信標(biāo)探針與其靶序列的雜交導(dǎo)致莖的分離，從而導(dǎo)致F/Q對的分離，產(chǎn)生熒光。

由于Dabcyl對寡核苷酸合成過程穩(wěn)定，它可以通過修飾子的形式摻入序列中的任何位置：在5'端使用5'-Dabcyl-CE Phosphoramidite——例如在TwistAmp fpg探針上的使用；在3'端使用3'-Dabcyl CPG——例如用于Taqman探針、蝎形引物和分子信標(biāo)；或在序列中間使用Dabcyl-dT-CE Phosphoramidite——例如在蝎形引物中。

Dabcyl的吸收特性將其可淬滅的染料范圍限制為發(fā)射波長為400-550nm（吸收波長為471nm）的染料。然而，當(dāng)在分子信標(biāo)中使用時，Dabcyl和熒光基團足夠接近，進而可以淬滅稍寬光譜的染料，從而增加了Dabcyl分子的通用性。

Dabcyl在大多數(shù)情況下已被BHQ系列染料取代。

2.2 黑洞淬滅劑

現(xiàn)代基因組和診斷應(yīng)用的需求通常集中在對更高檢測靈敏度的日益增長的需求上，這導(dǎo)致了一系列新的非熒光淬滅劑的開發(fā)。其中**的是Black Hole Quencher?試劑（BHQ試劑），它專門針對基于FRET的淬滅進行了優(yōu)化。

由于每種BHQ染料具有高消光系數(shù)和寬光譜重疊，因此與Dabcyl等分子相比，淬滅效率有所提高。這意味著BHQ染料為不同檢測目的提供了更大范圍波長的使用，覆蓋可見光到近紅外區(qū)域（480-730nm）。再加上這些分子沒有殘留背景熒光（是真正的暗淬滅劑），使BHQ染料成為real-time PCR應(yīng)用的有利選擇。

在四種BHQ淬滅劑中，BHQ-1和BHQ-2更受歡迎，無論5’-Phosphoramidites、dT-Phosphoramidites，或是3’-CPG。如果僅考慮激發(fā)和發(fā)射值，Cy5、Cyanine-5和Quasar 670需要BHQ-3才能**淬火，但建議使用BHQ-2，因為它不易降解。BHQ-1通常用于在480-580nm范圍內(nèi)的淬滅，可與常用熒光基團配合使用，如FAM、TET、JOE和HEX。BHQ-2用于在550-650nm范圍內(nèi)的淬滅，淬滅TAMRA、ROX、Cyanine-3、Cy3、Cy3.5?和Red 640等熒光基團**。每種BHQ亞磷酰胺和CPG均可直接用于自動化合成。

西安pg電子官方生物生物科技有限公司可以提供熒光標(biāo)記試劑：Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA、BHQ等。

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