產(chǎn)品名稱:親和純化蛋白標(biāo)簽6xHis的優(yōu)化策略
優(yōu)化策略
減少非特異性結(jié)合
增加洗滌步驟:使用高鹽(500 mM NaCl)或低濃度咪唑(50 mM)洗滌。
添加去垢劑:如0.1% Tween-20或CHAPS,減少疏水相互作用。
提高結(jié)合效率
優(yōu)化pH:大腸桿菌表達(dá)蛋白通常在pH 8.0結(jié)合,哺乳動(dòng)物細(xì)胞蛋白在pH 7.0-7.5。
降低流速:緩慢上樣(0.2-0.5 mL/min)可增強(qiáng)結(jié)合。
標(biāo)簽位置與去除
標(biāo)簽位置:N端標(biāo)簽可能影響蛋白分泌,C端標(biāo)簽更適用于分泌表達(dá)。
標(biāo)簽切除:用凝血酶(Thrombin)或TEV蛋白酶在特定位點(diǎn)切割標(biāo)簽,需在標(biāo)簽與目標(biāo)蛋白間設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)(如LEVLFQGP)。
處理包涵體
變性復(fù)性:用8 M尿素或6 M鹽酸胍溶解包涵體,再通過透析或稀釋逐步復(fù)性。
添加還原劑:如DTT或β-巰基乙醇,防止二硫鍵錯(cuò)誤配對(duì)。
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