文獻(xiàn)：細(xì)胞外囊泡交聯(lián)劑構(gòu)建具有應(yīng)力松弛和生物活性蛋白修飾的水凝膠

鏈接：https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC11388066/

作者：施祿豐， 景彥珍， 浩文路， 趙凡軒， 安夢瑩， 金水靈， 長高， 戴永東， 朱銀欣， 楊樹旭， 張松英， 葉雪松， 蔡秀君， 王一凡， 辛尚敬

節(jié)選：

EV交聯(lián)劑使蛋白質(zhì)能夠輕易地呈遞至封裝細(xì)胞

雖然EV交聯(lián)劑中的生物成分可能不會直接影響封裝的細(xì)胞，但使用EV交聯(lián)劑形成水凝膠的另一個(gè)優(yōu)勢是它們能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)呈遞到整個(gè)水凝膠基質(zhì)中。有效地將蛋白質(zhì)封裝在合成水凝膠中，同時(shí)保持其生物活性，這*具吸引力。[ 14 ]由于EV膜能夠容納多種功能性兩親分子，因此EV交聯(lián)劑的功能性遠(yuǎn)超典型的多功能交聯(lián)劑。[ 15 ]

在這里，我們展示了將兩種不同的 DSPE-PEG 兩親分子順序插入 EV 膜的潛力：DSPE-PEG-NHS 用于蛋白質(zhì)結(jié)合，DSPE-PEG-SH 用于水凝膠交聯(lián)（圖 4 a-c）。使用牛血清白蛋白（BSA）作為模型蛋白，我們顯示 BSA 帶在凝膠帶中向上移動，表明與 DSPE-PEG-NHS 結(jié)合后分子量增加，驗(yàn)證了 DSPE-PEG-BSA 的成功制備（圖 4b）。我們還表明，用 DSPE-PEG-SH 和 DSPE-PEG-BSA 修飾的 EV 可以通過硫醇-烯光聚合成功與 8 臂 PEG-Nb 交聯(lián)（圖 4d）。然而，加入 DSPE-PEG-BSA 后，水凝膠的儲能模量顯著降低，表明蛋白質(zhì)可能會干擾 EV 交聯(lián)反應(yīng)。為了進(jìn)一步探索蛋白質(zhì)呈遞，我們使用綠色熒光蛋白 (GFP) 作為模型蛋白，以可視化其在水凝膠中的分布。熒光成像顯示，GFP 均勻分布于 EV 交聯(lián)水凝膠中，證實(shí) GFP 已成功封裝到水凝膠網(wǎng)絡(luò)中（圖 4e,f）。

圖4

EV交聯(lián)劑能夠有效地將蛋白質(zhì)遞送到水凝膠網(wǎng)絡(luò)中，同時(shí)保留蛋白質(zhì)的生物活性。a）DSPE-PEG-蛋白質(zhì)合成示意圖，其中DSPE-PEG-NHS通過疏水相互作用與蛋白質(zhì)偶聯(lián)。b）BSA和DSPE-PEG-BSA的凝膠電泳結(jié)果，驗(yàn)證了DSPE-PEG-蛋白質(zhì)的成功合成。c）示意圖說明通過將DSPE-PEG-蛋白質(zhì)和DSPE-PEG-SH與EV共培養(yǎng)形成SH-EV-蛋白質(zhì)復(fù)合物。d）通過硫醇-烯光聚合使用SH-EV-BSA交聯(lián)的水凝膠和流變測試顯示通過PEG-SH和SH-EV-BSA交聯(lián)的水凝膠的儲能模量。 e、f) PEG-SH 和 SH-EV-GFP 交聯(lián)水凝膠中的熒光圖像和 GFP 熒光信號定量。比例尺，100 ?m。g) SH-EV-VEGF 促進(jìn) HUVEC 聚集和發(fā)芽（血管生成指標(biāo)）的分布示意圖。h) 使用 TRITC Phalloidin 和 DAPI 染色，在第 5 天對 PEG-SH、EV-SH 和 SH-EV-VEGF 交聯(lián)水凝膠中的 HUVEC 生長進(jìn)行 Z 投影共聚焦圖像。比例尺，100 ?m。i) PEG-SH、EV-SH 和 SH-EV-VEGF 交聯(lián)水凝膠中的血管芽長度和 j) 細(xì)胞簇分析。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。在 d、f（ n = 3）中使用單尾非配對 t 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，在 i、j（ n = 10-15）中使用單因素方差分析進(jìn)行成對比較。

為了評估負(fù)載到 EV 交聯(lián)劑上的蛋白質(zhì)的生物功能，我們使用 VEGF 作為示例蛋白質(zhì)，并將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (HUVEC) 封裝在 SH-EV-VEGF 交聯(lián)水凝膠中（圖 4g）。培養(yǎng)五天后，雖然 HUVEC 在用 8 臂 PEG-SH 交聯(lián)的水凝膠中保持圓形和隔離，但 EV 交聯(lián)水凝膠中的細(xì)胞開始聚集，表明 EV 交聯(lián)水凝膠的應(yīng)力松弛特性允許細(xì)胞移動和聚集（圖 4h-j）。值得注意的是，細(xì)胞簇在 SH-EV-VEGF 交聯(lián)水凝膠中更為突出。有趣的是，我們觀察到 SH-EV-VEGF 交聯(lián)水凝膠中的一些細(xì)胞簇發(fā)芽實(shí)例，表明有血管生成趨勢（圖 4h-j）。在某些情況下，發(fā)芽幾乎連接了兩個(gè)獨(dú)立的簇，驗(yàn)證了加載到 EV 交聯(lián)劑上的蛋白質(zhì)可以維持其生物功能并影響封裝細(xì)胞的行為。

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