陽(yáng)離子脂質(zhì)體包載熒光標(biāo)記siRNA技術(shù)（Cationic Liposome-Based siRNA Fluorescent Delivery Technology）

陽(yáng)離子脂質(zhì)體包載siRNA（熒光）技術(shù)，是當(dāng)前RNA干擾（RNAi）藥物體內(nèi)遞送中一種被廣泛研究與應(yīng)用的非病毒遞送策略。該技術(shù)利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體與帶負(fù)電荷的siRNA分子之間的靜電作用，形成穩(wěn)定的脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物，并通過熒光標(biāo)記實(shí)現(xiàn)體外/體內(nèi)示蹤、細(xì)胞攝取評(píng)估與分布可視化。該方法具有高效遞送、靶向修飾靈活、低免疫原性、可控釋放等優(yōu)勢(shì)，在腫瘤治療、遺傳疾病、病毒感染等領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊前景。

一、技術(shù)核心原理

陽(yáng)離子脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)組成：

陽(yáng)離子脂質(zhì)（如DOTAP、DC-Chol、DODMA）：提供正電荷，與siRNA形成復(fù)合體；

中性輔助脂質(zhì)（如DOPE、Cholesterol）：增強(qiáng)膜融合、穩(wěn)定性；

PEG化脂質(zhì)（如DSPE-PEG）：改善血液穩(wěn)定性、減少網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除；

靶向/熒光功能脂質(zhì)（如DSPE-PEG-Cy5、FITC-DOPE）：實(shí)現(xiàn)示蹤與細(xì)胞成像。

siRNA包載方式：

靜電復(fù)合：陽(yáng)離子脂質(zhì)體與siRNA混合后，正負(fù)電荷相互作用形成脂質(zhì)/siRNA復(fù)合體（lipoplex）；

包載效率與質(zhì)量比（N/P ratio，常在5:1~10:1）密切相關(guān)。

熒光標(biāo)記方式：

直接標(biāo)記siRNA：使用FITC-siRNA、Cy3-siRNA、Cy5-siRNA等合成標(biāo)記鏈；

間接標(biāo)記脂質(zhì)體：在脂質(zhì)體表面插入熒光脂質(zhì)（如DSPE-PEG-Cy5），標(biāo)記整個(gè)復(fù)合體；

雙重標(biāo)記（siRNA與脂質(zhì)體同時(shí)標(biāo)記）可用于跟蹤釋放過程。

二、制備方法與步驟

脂質(zhì)體配制

采用薄膜水化法或微流控法將陽(yáng)離子脂質(zhì)與輔助脂質(zhì)混合成脂質(zhì)體；

可預(yù)先加入熒光標(biāo)記脂質(zhì)（如DSPE-PEG-FITC）或膜嵌入式染料（DiI、DiR）。

siRNA包載

將陽(yáng)離子脂質(zhì)體與熒光siRNA按設(shè)定N/P比混合，在緩沖液中孵育10–30分鐘；

形成均一脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合體，大小約在80–200 nm，表面帶正電。

修飾與穩(wěn)定化（可選）

加入PEG修飾脂質(zhì)或靶向配體（如抗體、HA、RGD等）；

可進(jìn)一步冷凍干燥或制成注射用脂質(zhì)體制劑。

三、關(guān)鍵參數(shù)控制

四、應(yīng)用與驗(yàn)證

細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

使用FITC-siRNA或Cy5-siRNA脂質(zhì)體處理細(xì)胞，采用共聚焦顯微鏡或流式細(xì)胞術(shù)（FACS）觀察進(jìn)入效率；

可進(jìn)一步使用Lysotracker共染色觀察胞內(nèi)釋放行為。

RNAi功能驗(yàn)證

轉(zhuǎn)染后檢測(cè)靶基因mRNA或蛋白水平（qPCR、Western blot）；

可對(duì)照裸siRNA或陰性脂質(zhì)體組。

體內(nèi)分布成像

Cy5或DiR標(biāo)記脂質(zhì)體用于小動(dòng)物活體熒光/近紅外成像，分析靶向能力與分布時(shí)間；

腫瘤模型中可評(píng)估腫瘤富集效果。

治療效果評(píng)估

熒光siRNA脂質(zhì)體遞送治療相關(guān)基因（如VEGF、Bcl-2、KRAS等），觀察瘤體積變化、存活期等指標(biāo)。

五、典型應(yīng)用案例

Cy5-siRNA@DOTAP/Chol/DSPE-PEG脂質(zhì)體：用于腫瘤靶向沉默VEGF基因，降低血管生成；

FITC-siRNA@DODMA/DOPE脂質(zhì)體：在pH條件下促使siRNA釋放，用于肺部炎癥治療；

ICG/siRNA共載陽(yáng)離子脂質(zhì)體：實(shí)現(xiàn)光熱/基因聯(lián)合治療，近紅外成像引導(dǎo)；

HA修飾陽(yáng)離子脂質(zhì)體遞送siRNA：增強(qiáng)CD44+腫瘤細(xì)胞靶向性。

六、優(yōu)勢(shì)與局限

優(yōu)勢(shì)：

包載效率高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；

生物相容性好、非病毒遞送安全；

熒光可視化，實(shí)現(xiàn)遞送追蹤和治療監(jiān)控；

可擴(kuò)展為多功能系統(tǒng)（如靶向、響應(yīng)、聯(lián)合治療）。

局限與挑戰(zhàn)：

陽(yáng)離子脂質(zhì)體在高劑量下可能引起細(xì)胞毒性與免疫反應(yīng)；

熒光信號(hào)易受猝滅或光漂白影響；

熒光標(biāo)記的siRNA成本較高，體內(nèi)穩(wěn)定性需優(yōu)化；

長(zhǎng)循環(huán)與靶向之間存在“PEG屏蔽”效應(yīng)，需要設(shè)計(jì)可脫P(yáng)EG系統(tǒng)。

總結(jié)：
陽(yáng)離子脂質(zhì)體包載熒光siRNA技術(shù)集成了高效遞送、追蹤成像、智能釋放與基因沉默于一體，已成為siRNA遞送體系的重要方向之一。通過結(jié)構(gòu)優(yōu)化、探針篩選與靶向修飾，該技術(shù)可定制適用于腫瘤治療、炎癥調(diào)控、基因修復(fù)、疫苗遞送等多個(gè)前沿領(lǐng)域的解決方案。歡迎提出具體靶點(diǎn)、模型或探針需求，可進(jìn)一步進(jìn)行個(gè)性化定制設(shè)計(jì)。

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