熒光染色原理及免疫熒光染色簡介

免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時，只要知道其中的一個因素，就可以查出另一個因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體(或抗原)上，與其相應(yīng)的抗原(或抗體)結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。

免疫熒光染色：細(xì)胞膜上或細(xì)胞內(nèi)的抗原分子與相應(yīng)的熒光素標(biāo)記McAb（單克隆抗體）作用一定時間后形成帶有熒光素的抗原抗體復(fù)合物，經(jīng)激光激發(fā)后發(fā)出特定的熒光，其熒光強(qiáng)度與被測定抗原分子含量呈比例關(guān)系，由此可求得被測細(xì)胞與標(biāo)記McAb（單克隆抗體）相對應(yīng)抗原的表達(dá)量和陽性細(xì)胞百分比。

常用的熒光染料：

綠色熒光：FITC（異硫氰酸熒光素）、 Alexa Fluor 488和GFP；

紅色熒光：TRITC（羅丹明）、Cy3（花菁）、Alexa Fluor 568&594和MitoTrackerRed；

藍(lán)色熒光：Hoechst、DAPI；

黃色熒光：YFP、Fluo-3和Rhoda-minel23

不同熒光素經(jīng)激光激發(fā)后其發(fā)射熒光光譜有差別，因而可將其用于標(biāo)記不同的McAb（單克隆抗體）進(jìn)行單色或多色免疫熒光染色。目前，流式細(xì)胞術(shù)有單色、雙色、三色、四色、五色熒光分析，對細(xì)胞的分析更加精密、深入。

免疫熒光染色常用方法：

直接免疫熒光法：用一種（單色）或者多種（多色）熒光素標(biāo)記的McAb（單克隆抗體）染色細(xì)胞后測量其熒光強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)。

間接免疫熒光法：用一種McAb（單克隆抗體）與細(xì)胞作用后，洗去未結(jié)合McAb，再加入熒光素標(biāo)記的**抗體（如羊抗鼠IgG-FITC），染色細(xì)胞后測量其熒光強(qiáng)度及陽性細(xì)胞數(shù)。