熒光素/花菁Cy染料熒光標(biāo)記DNA與RNA核酸

熒光素（FAM）標(biāo)記單鏈DNA(FAM-DNA)核酸探針：

MicroRNA（miRNA）是一類長約19至25個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，它在個(gè)體生物發(fā)育分化等生命活動(dòng)中有著重要調(diào)節(jié)作用，并且miRNA的表達(dá)與癌癥等重大疾病的發(fā)病密切相關(guān)，因此實(shí)現(xiàn)miRNA的靈敏檢測具有重要的意義。有研究表明，氧化石墨烯（GO）能夠**猝滅多種染料的熒光，并且具有優(yōu)良的生物相容性、高吸附能力等優(yōu)點(diǎn)，因此將GO作為熒光的猝滅基團(tuán)，構(gòu)建基于GO與染料（或染料標(biāo)記的生物分子）之間的能量共振轉(zhuǎn)移體系，已經(jīng)成為熒光生物傳感器領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

以熒光素（FAM）標(biāo)記的單鏈DNA(FAM-DNA)作為核酸探針，加入GO后，由于FAM-DNA探針與GO之間存在較強(qiáng)的π-π堆積效應(yīng)，因此FAM-DNA探針會(huì)迅速的吸附到GO的表面，F(xiàn)AM-DNA探針的熒光素基團(tuán)與GO發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致FAM-DNA探針的熒光信號(hào)被完全猝滅；然而，加入目標(biāo)分子miRNA時(shí)，F(xiàn)AM-DNA探針和目標(biāo)分子通過堿基配對(duì)原則雜交形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，當(dāng)GO存在時(shí)，由于雙鏈核酸分子自身的雙螺旋剛性結(jié)構(gòu)，其與GO的結(jié)合能力**降低，不會(huì)被吸附在GO表面，從而可保持其熒光信號(hào)。熒光信號(hào)的強(qiáng)弱與體系中miRNA的濃度成正比，從而實(shí)現(xiàn)了miRNA的定量檢測�！　�

在此基礎(chǔ)上，我們利用酶切放大機(jī)制來進(jìn)一步提高該方法對(duì)miRNA檢測的靈敏度。我們引入一種特異性雙鏈核酸酶（DSN），DSN能夠特異性切割完全匹配的DNA雙鏈或者RNA與DNA完全匹配雜交雙鏈中的DNA，對(duì)單鏈的DNA或者RNA無任何作用。在上述實(shí)驗(yàn)原理基礎(chǔ)上，當(dāng)目標(biāo)分子miRNA與FAM-DNA探針雜交形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)時(shí)，加入DSN酶，DSN酶切割雜交雙鏈結(jié)構(gòu)中的FAM-DNA探針，切碎后的熒光基團(tuán)不能被GO吸附，同時(shí)目標(biāo)分子miRNA被釋放出來，再次與其它的FAM-DNA探針雜交，DSN酶再切割FAM-DNA探針，如此循環(huán)反復(fù)進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)了一個(gè)目標(biāo)分子與多個(gè)FAM-DNA探針循環(huán)雜交、切割，大量的熒光基團(tuán)被釋放出來，體系的熒光信號(hào)被**放大，通過檢測體系熒光信號(hào)的變化，實(shí)現(xiàn)了對(duì)miRNA的高靈敏度檢測。該方法實(shí)驗(yàn)原理簡單，背景干擾小，操作快速簡單，可檢測到低至60pM的目標(biāo)分子miRNA。

Cy5標(biāo)記核酸片段：

DNA疫苗是一種能夠作為疫苗使用的DNA序列。這一序列來自于病原體，編碼病原體的蛋白。將此序列克隆到真核表達(dá)載體上并將構(gòu)建的重組質(zhì)粒注入到宿主體內(nèi)，并使外源基因得以表達(dá)，從而激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，引發(fā)抗體反應(yīng)，可以達(dá)到消滅病原體的目的�！　�

**、特異地將DNA疫苗導(dǎo)入到抗原遞呈細(xì)胞中并使它得到**表達(dá)是提高DNA疫苗免疫活性的根本途徑。細(xì)菌菌蛻(bacterial ghost，BG)是使用裂解酶將細(xì)菌裂解、去除菌體內(nèi)容物之后形成的空腔。BG周質(zhì)腔內(nèi)膜和外膜相互鏈接一個(gè)具有完整的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，可用于裝載質(zhì)粒DNA。BG還能夠被宿主DC識(shí)別、吞噬，靶向性將DNA疫苗導(dǎo)入DC細(xì)胞，增強(qiáng)DNA疫苗的免疫活性。
　　以BG為載體制備雙重靶向DNA疫苗：首先利用BG將DNA疫苗靶向性的導(dǎo)入樹突狀細(xì)胞(DC)、并獲得**表達(dá)；其次將編碼抗原的基因片段構(gòu)建在Ii載體中，內(nèi)源靶向性地將表達(dá)產(chǎn)物遞交給MHC-Ⅱ分子，進(jìn)一步提高抗原提呈能力和免疫應(yīng)答水平。

1. 大腸桿菌ghost的制備及鑒定。
　　2.BG裝載核酸片段和質(zhì)粒DNA，并轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞RAW264.7
　　 將成功制備的BG與CY5標(biāo)記的核酸片段按不同濃度混合、孵育，離心收集采用Mito Tracker將BG染色后，流式細(xì)胞術(shù)檢測裝載效率，發(fā)現(xiàn)在**條件下，95％的BG內(nèi)均裝載了熒光標(biāo)記的DNA片段。在此基礎(chǔ)上裝載PI染色的質(zhì)粒pDSRed-N1，裝載效率可達(dá)91.98％。將裝載有質(zhì)粒pDSRed-N1的菌蛻轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞RAW264.7，轉(zhuǎn)染48h后采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察RAW264.7細(xì)胞內(nèi)吞BG的過程及Red基因的轉(zhuǎn)染效率，發(fā)現(xiàn)在50-60％轉(zhuǎn)染細(xì)胞中可同時(shí)觀察到綠色熒光信號(hào)(即Mito Tracker標(biāo)記的BG)和紅色熒光信號(hào)(DsRed編碼的紅色熒光蛋白)。結(jié)果提示BG可發(fā)揮外源性靶向作用，**地將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入巨噬細(xì)胞(抗原提呈細(xì)胞)，并獲得較高的表達(dá)水平。
　　3.FMDV內(nèi)源性靶向DNA疫苗的構(gòu)建
　  4.VP1抗原的表達(dá)和純化
　　5.細(xì)胞轉(zhuǎn)染和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　以上結(jié)果初步證實(shí)，采用BG為載體或?qū)�DNA疫苗構(gòu)建到內(nèi)源性靶向載體上均可提高疫苗的免疫原性，而采用雙重靶向載體技術(shù)可進(jìn)一步提高DNA疫苗的免疫原性水平。采用本方法制備的疫苗還可以是多價(jià)的，首先若以BG裝載2種或多種DNA疫苗，就對(duì)多種疾病產(chǎn)生免疫反應(yīng)；其次若選取特定的致病性細(xì)菌制備BG，那么在使用疫苗之后，就可以在DNA疫苗發(fā)生作用的同時(shí)對(duì)特定的致病性細(xì)菌產(chǎn)生免疫保護(hù)作用。我們相信，隨著雙重靶向疫苗制備技術(shù)的完善，本研究策略有可能在未來的新型疫苗研究中發(fā)揮重要作用。

熒光標(biāo)記物：

異硫氰酸熒光素FITC、CY3、CY3.5、CY5、CY7、羅丹明等熒光標(biāo)記

熒光標(biāo)記單克隆抗體多克隆抗體或重組抗體

熒光修飾的多肽（各種序列號(hào)的多肽、靶向肽、穿膜肽、環(huán)肽、序列肽)

熒光標(biāo)記磷脂（DSPE、DOPE、DMPE、DPPE、DPG、DPPS等磷脂）

高分子聚合物的熒光標(biāo)記

單糖、多糖、聚糖、寡糖、脂多糖、瓊脂糖熒光標(biāo)記/近紅外熒光標(biāo)記

熒光定制標(biāo)記藥物、小分子、抑制劑、醫(yī)藥中間體、生物活性小分子

氨基酸及聚氨基酸的熒光標(biāo)記

熒光標(biāo)記DNA與RNA核酸

熒光標(biāo)記核酸及衍生物

熒光標(biāo)記核糖、核苷、核酸及其衍生物

熒光標(biāo)記核酸類藥物（寡核苷酸、質(zhì)粒DNA、siRNA等）

脂質(zhì)體的熒光標(biāo)記

熒光標(biāo)記空白對(duì)照脂質(zhì)體

熒光標(biāo)記載藥脂質(zhì)體

熒光標(biāo)記裝載DNA或小分子脂質(zhì)體

熒光標(biāo)記多室脂質(zhì)體

熒光標(biāo)記多囊脂質(zhì)體

熒光標(biāo)記免疫脂質(zhì)體

熒光標(biāo)記熱敏脂質(zhì)體

熒光標(biāo)記PEG化的脂質(zhì)體

熒光標(biāo)記配體靶向性脂質(zhì)體

熒光標(biāo)記長循環(huán)脂質(zhì)體

熒光標(biāo)記陽離子脂質(zhì)體

熒光標(biāo)記熒光脂質(zhì)體

熒光標(biāo)記中性脂質(zhì)體

熒光標(biāo)記負(fù)電荷脂質(zhì)體正電荷脂質(zhì)體

熒光標(biāo)記磁性脂質(zhì)納米顆粒

熒光標(biāo)記載雙藥或者多藥脂質(zhì)體

熒光標(biāo)記酸敏脂質(zhì)體

熒光標(biāo)記PLGA微球和納米粒子

熒光標(biāo)記樹狀分子、脂質(zhì)聚合物

熒光標(biāo)記冠醚、環(huán)糊精、葫蘆脲、杯芳烴衍生物、卟啉、酞菁

熒光標(biāo)記各種細(xì)胞(干細(xì)胞、活細(xì)胞、細(xì)胞核）

碳水化合物的熒光標(biāo)記

酶與輔酶的熒光標(biāo)記（溶菌酶、過氧化物酶、脂肪酶）

熒光標(biāo)記碳納米材料（碳納米管、富勒烯、碳納米角）

金屬與陶瓷材料的熒光標(biāo)記

熒光標(biāo)記的微球-紅色、橙色、綠色、藍(lán)色、黃色、核酸、紫色

離子液體的熒光標(biāo)記

熒光標(biāo)記有機(jī)硅化合物（有機(jī)硅球、包裹Fe3O4硅球、介孔硅球、載藥硅球）

熒光標(biāo)記金納米粒子/銀納米粒子

熒光標(biāo)記二氧化硅納米粒子/氧化鐵納米粒子

熒光標(biāo)記量子點(diǎn)

磷脂氨基酸的熒光標(biāo)記

熒光標(biāo)記可生物降解的聚合物

熒光標(biāo)記天然聚合物

熒光標(biāo)記嵌段共聚物

熒光標(biāo)記親水聚合物

抗體磁珠的熒光標(biāo)記

超分子材料的熒光標(biāo)記

蛋白酶抑制劑的熒光標(biāo)記

雜環(huán)的熒光標(biāo)記

光電材料的熒光標(biāo)記（有機(jī)光電、電子材料、光電中間體、摻雜材料）

熒光標(biāo)記生物磁珠

造影劑的熒光標(biāo)記

熒光標(biāo)記代謝物

熒光標(biāo)記重組蛋白

熒光標(biāo)記生物大分子