熒光素酶（luciferase，Luc）是指能催化不同底物（如熒光素、腔腸素等）發(fā)生氧化使其發(fā)射出熒光的一類酶的總稱，在許多昆蟲、海洋生物和原核生物中均能分離得到。目前最常用的熒光素酶有細菌熒光素酶（bacterial luciferase，BL）和螢火蟲熒光素酶（firefly luciferase，FL）兩大類。細菌熒光素酶是一種具有熱不穩(wěn)定性的異源蛋白二聚體，含有α、β 兩個多肽亞基的加單氧酶，它能催化長鏈脂肪醛、還原性黃素（FMNH2）和O2的氧化反應(yīng)，發(fā)出藍綠光（λ=490 nm）。螢火蟲熒光素酶由單一多肽鏈組成，在Mg2+、ATP、O2 存在時，催化D-熒光素（D-Luciferin）氧化脫羧發(fā)光（λ=550~580 nm），FL 的檢測線性范圍寬達7～8 個數(shù)量級，檢測靈敏度可達10的-19次方mol（比CAT 高100倍），現(xiàn)已成為哺乳細胞中的最常使用的報告基因。高靈敏度、多用途、半衰期短、背景**和相對簡單的分析方法是螢火蟲熒光蛋白流行使用的主要原因。常用的檢測熒光素酶的方法有液閃法和光照度計法。隨著具有膜透過性和光裂解作用的螢火蟲熒光素酶的發(fā)現(xiàn)和使用，無需裂解細胞即可檢測酶的活性。

熒光素酶普遍具有靈敏度高、檢測快速、方便等特點。熒光素酶通過載體構(gòu)建可以研究基因組織的特異性表達；對一些細胞的生長和轉(zhuǎn)移等變化進行實時觀測和評估；在驗證miRNA 靶基因中熒光報告載體實驗則是目前的常用方法；有些情況如用逆轉(zhuǎn)錄酶病毒構(gòu)建的方法在較長時間的培養(yǎng)中則發(fā)現(xiàn)表達熒光素酶的能力下降。熒光素酶能與蛋白產(chǎn)生融合，可以構(gòu)建雙報告基因的表達系統(tǒng)，如海腎熒光素酶與紅色熒光蛋白、螢火蟲熒光素酶與綠色熒光蛋白以及螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶等雙表達系統(tǒng)。目前這類報告基因發(fā)展迅速、應(yīng)用領(lǐng)域日趨廣泛。

海腎熒光素酶基因（renilla luciferase，Rluc）是一種新型的熒光素酶報告基因，近年來發(fā)展迅速。該基因的cDNA 是從海洋中的珊瑚蟲類腔腸動物海腎中克隆而來，然后與pRL 載體相連構(gòu)建而成。Rluc 表達的蛋白是一種36 kD的單體酶（RLUC），能夠催化可穿透細胞膜的腸腔酶氧化并發(fā)出熒光，酶在與其底物相互作用后，隨著螢光素的氧化而發(fā)出熒光，并且反應(yīng)效率很高，幾乎所有輸入反應(yīng)的能量都被轉(zhuǎn)化為光。還有研究認為，接觸反應(yīng)基團與熒光生成的去碳酸基反應(yīng)直接相關(guān)，其他活性產(chǎn)物可用于底物的結(jié)合。在活細胞內(nèi)，Rluc 表達產(chǎn)物還能作為Ca2+的熒光指示劑。

海腎熒光素酶作為一種新型的熒光素酶報告基因，有著更**的優(yōu)點：（1）低背景，靈敏度高，可檢測10的-19次方mol 的海腎熒光素酶，比已發(fā)表的方法靈敏度高幾個數(shù)量級；（2）線性范圍廣，能得到可靠的、超過7 個數(shù)量級酶活力的結(jié)果；（3）RLUC 的檢測既可用終點法檢測，也可用于非裂解性檢測。

目前已經(jīng)有**成熟的可同時檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的系統(tǒng)，我們通常稱為雙熒光素酶報告系統(tǒng)。

基本原理

由于miRNA主要通過作用于靶基因的3’UTR起作用，可以將目的基因3’UTR區(qū)域構(gòu)建至報告基因luciferase的后面，通過比較過表達或者干擾miRNA后，報告基因表達的改變（監(jiān)測熒光素酶的活性變化）可以定量反映miRNA對目的基因的**作用。

進行驗證實驗之前已經(jīng)準備好的內(nèi)容如下：

靶基因的3UTR序列；

研究的miRNA的mimics；

實驗流程:

需要將靶基因的3’UTR構(gòu)建入pmirGLO載體中，載體圖譜如下：

該載體包含螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶雙報告基因，實驗中需要將靶基因的3’UTR 通過該載體的多克隆位點連入螢火蟲熒光素酶報告基因的下游。

獲得靶基因的3’UTR可通過PCR獲得，該方法引物設(shè)計時候需要在引物上添加相應(yīng)的與載體合適的酶切位點和保護堿基（以人的GAPDH為例可選擇NheI和XbaI兩個酶切位點）。

也可通過化學(xué)合成的方法直接合成靶基因的3’UTR 并連入pmirGLO載體中，也需要用到相應(yīng)的酶切位點。構(gòu)建好的質(zhì)�？梢悦�名為WT。

在WT的基礎(chǔ)上通過點突變或者化學(xué)合成的方法構(gòu)建MUT質(zhì)粒。

需要根據(jù)miRNA的種子區(qū)序列將對應(yīng)種子區(qū)序列結(jié)合的靶基因3’UTR的序列突變，使miRNA不能與MUT質(zhì)粒上的靶基因的3’UTR結(jié)合，通常大部分文獻中習(xí)慣將結(jié)合序列突變?yōu)閷��?yīng)的互補序列，例如：原結(jié)合序列為ACTAAGG,突變后序列為TGATTCC。

構(gòu)建好WT和MUT質(zhì)粒后進行相應(yīng)的細胞轉(zhuǎn)染，細胞的選擇需要根據(jù)轉(zhuǎn)染難易程度、內(nèi)源性miRNA表達量等因素綜合選擇。

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zzj 2021.3.8