免疫沉淀、ChIP、蛋白互作、親和純化等實(shí)驗(yàn)里,核心的環(huán)節(jié)就是用微球進(jìn)行目標(biāo)蛋白的釣取純化 ,而較常用的就是各種包被的瓊脂糖微球,而隨著大家對回收率、純度以及實(shí)驗(yàn)便捷性的要求提升,越來越多的人開始選用磁性微球。
磁性微球相比瓊脂糖微球的優(yōu)勢:
回收率高
瓊脂糖純化中,瓊脂糖珠在離心之后,棄去上清。在吸液過程中,為了盡可能移去上清,往往會吸走一部分瓊脂糖,這樣就可能損失一部分目的蛋白。同時,瓊脂糖珠在離心過程中也可能破裂,這樣就又損失了一部分目的蛋白。
磁珠純化中,攜帶目的蛋白的磁珠通過磁性吸附在管壁上,此時吸取上清不會“捎帶”走帶有目的蛋白的磁珠,而磁珠也不需要應(yīng)付頗具考驗(yàn)的離心步驟,這樣雙管齊下就保證了磁珠比瓊脂糖珠有更高的回收率,對于蛋白互作、ChIP實(shí)驗(yàn)來說,更容易獲得可靠的檢出結(jié)果。而對于RIP這樣對于檢測靈敏度要求更高的實(shí)驗(yàn)來說,基于磁珠的純化是**推薦的途徑。
特異性好
瓊脂糖純化中,瓊脂糖珠本身結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜,容易非特異性結(jié)合蛋白和DNA,對于蛋白互作研究或者ChIP實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生非特異性的干擾。此外,在離心去除上清的過程中,也可能由于吸取上清不徹底,從而殘留一些實(shí)際未與微球結(jié)合的蛋白/DNA,從而產(chǎn)生非特異性結(jié)果。
磁珠純化中,由于磁珠表面光滑,非特異性結(jié)合率**,因此背景比瓊脂糖低的多。另外由于磁珠純化時,去除上清更加徹底,殘留的未結(jié)合蛋白/DNA對結(jié)果的干擾也能被去除。
瓊脂糖微球的非特異性結(jié)合
瓊脂糖天然的非特異性結(jié)合屬性往往會給實(shí)驗(yàn)帶來意想不到的背景,需要**設(shè)置多個對照和反復(fù)實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行核實(shí)與驗(yàn)證。而對于ChlP實(shí)驗(yàn)來說,也不能直接使用普通瓊脂糖珠,而是需要先用鮭魚精DNA等試劑進(jìn)行封閉
操作簡便速度快
在IP實(shí)驗(yàn)中,瓊脂糖珠、抗體、目標(biāo)蛋白往往需要很長時間的孵育才能充分進(jìn)行結(jié)合。而使用磁珠后,往往只需要更短的時間就可以完成充分的結(jié)合,這**的提升了實(shí)驗(yàn)速度。
同時,磁珠無需進(jìn)行離心,可以使用磁力架進(jìn)行“秒速”分離,可以迅速進(jìn)行后續(xù)的去上清、清洗步驟。再也不用盯著瓊脂糖珠的固液界面小心翼翼的進(jìn)行上清分離了。
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Oligo dT磁珠 |
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wyf 02.01