原理:TMB (3',3',5',5',-四甲苯聯(lián)苯胺）是辣根過氧化物酶（HRP)的顯色底物，HRP能催化TMB顯色底物形成藍(lán)色的陽(yáng)離子產(chǎn)物，主要在―37Onm和 652nm有吸收峰，當(dāng)加入酸終止反應(yīng)后，藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色，可以在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定 OD值。

一、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

稱取1mg HRP固體粉末，加入 1mL ddH O，即為 1mg/mL，再分別稀釋成0.0001 、 0.0002、0.0004、0.0008 、 0、0016、0.0032、0.0064、0.0128、0.0256ug/mL,分別取_10uL，加入100uLTMB顯色底物，15min后加入50uL 2M H,SOs終止反應(yīng)，立即測(cè)定OD450值，以HRP質(zhì)量為橫坐標(biāo)，OD450值為縱坐標(biāo)，繪制HRP酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線。

二、鋪板、轉(zhuǎn)染

三、測(cè)定細(xì)胞吞入的HRP含量

1、轉(zhuǎn)染后6h后，將6孔板中的培養(yǎng)基吸出，取500uL DPBS沿皿壁加入到每個(gè)孔中，洗滌

細(xì)胞一次，立即吸取 2mL無FBS的 DMEM 培養(yǎng)基使細(xì)胞饑餓16h 。

2、事先用無 FBS 的 DMEM 配置1mg/mLHRP，并避光處理，16h后培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基吸出，

每孔中加入80OuL的HRP溶液置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中10min 。

3、10min后立即將上清吸取到 15mL離心管中回收，DPBS洗滌細(xì)胞一次，之后每孔中加入

200uL 胰酶，消化細(xì)胞。加入 1mL DPBS重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到1.5mLEP管中，3000rpm ,4℃離心2min,重復(fù)該步一次，上清倒掉，3000rpm，4℃離心1min，將上清吸干凈。4、配置裂解液，用強(qiáng)RIPA裂解液（ 50mM Tris-cl pH7.4，150mM Nacl，1%TritonX-100 )

中加入100×PMSF和50×PIC兩種蛋白酶**劑。之后分別取50uL將細(xì)胞沉淀重懸，并放到混懸儀上 4℃裂解細(xì)胞1.5h。

5、待細(xì)胞充分裂解后14000rpm，4℃離心10min，將上清轉(zhuǎn)移到新的 1.5mLEP管中。

6、取5uL細(xì)胞裂解液加入到 45uLddH :O中，稀釋10，渦旋混勻后取 10uL加到96孔板中，

做3個(gè)平行樣，用排槍加入100uL TMB 顯色底物(TMB bufferA與 TMB bufferB等體積混合)，室溫避光顯色15min，加入50uL 2M H zSO4終止反應(yīng)，立即用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450值。

7、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞吞入的HRP含量。

TMB bufferA : 500mL

NaAc·3H zO 13.6 g

Citric Acid1.6 g

30% HzO:0.3 ml

Add ddH O to 500 ml

TMB bufferA : 500mL

TMB (first dissolved in 3 ml DMSO) 0.15 g

EDTA-2Na 0.2g

Critic Acid 0.95

gGlycerol 50 ml

Add ddH 20 to 500 ml

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