外泌體與靶向載體技術(shù)

外泌體作為靶向載體的優(yōu)勢(shì)

　　外泌體和脂質(zhì)體與納米材料載體相比有很多優(yōu)勢(shì)，例如：低免疫原性，來源于DC的外泌體含有主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ類和Ⅱ類分子［23］，因此不會(huì)被免疫細(xì)胞清除；半衰期長，外泌體表面高表達(dá)CD47蛋白，CD47蛋白是一種廣泛表達(dá)的整聯(lián)蛋白相關(guān)跨膜蛋白，是信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α（signal regulatory protein α，SIRPα）的配體，CD47-SIRPα結(jié)合引發(fā)“不要吃我”**吞噬作用的信號(hào)，可以防止外泌體被單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞吞噬，增加外泌體在體內(nèi)的半衰期；外泌體還具有穿透血腦屏障、胎盤屏障的能力；外泌體可以與傳統(tǒng)的病毒載體結(jié)合使用，形成一種功能更強(qiáng)的基因**工具，如Orefice等利用外泌體包裹腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）載體來靶向**神經(jīng)退行性疾病，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得了良好的效果，為腦部疾病的**帶來了希望。外泌體載體的以上優(yōu)勢(shì)吸引了越來越多的研究者去研究外泌體載體，拓展了外泌體載體的應(yīng)用范圍。

外泌體作為靶向**載體的基礎(chǔ)

　　外泌體在細(xì)胞間的通訊交流中扮演著重要角色，在人體中，外泌體攜帶著蛋白、核酸和脂質(zhì)等大量生命信息，需要遵循人體運(yùn)行的有序性，否則必然會(huì)導(dǎo)致人體信息傳遞的錯(cuò)亂，破壞人體功能的平衡，所以有理由相信外泌體在體內(nèi)是靶向運(yùn)輸?shù)�，這為開發(fā)外泌體的靶向改造提供了可能性。通過改造產(chǎn)生外泌體的母細(xì)胞，使其分泌的外泌體膜表面產(chǎn)生靶向目標(biāo)細(xì)胞的蛋白，從而使外泌體產(chǎn)生所需的靶向性，證明可以對(duì)外泌體進(jìn)行靶向性改造。之后越來越多的研究涌向外泌體的靶向**領(lǐng)域。

外泌體的靶向性改造技術(shù)

外泌體的產(chǎn)生受親本基因的控制，通過基因工程手段導(dǎo)入融合歸巢蛋白和外泌體的轉(zhuǎn)膜蛋白的基因到親本細(xì)胞中，使得想要的蛋白展示在外泌體膜表面。對(duì)外泌體進(jìn)行靶向改造的過程就是膜蛋白展示的過程。目前已經(jīng)驗(yàn)證的轉(zhuǎn)膜蛋白和歸巢蛋白的組合見表1

歸巢蛋白與在外泌體膜表面已知富集的跨膜蛋白融合，從而展示在外泌體膜表面。對(duì)于利用乳凝集素C1C2結(jié)構(gòu)域作為錨定點(diǎn)的組合，因?yàn)槟�集素是膜相關(guān)蛋白，而不是跨膜蛋白，所以使用凝集素C1C2結(jié)構(gòu)域作為外泌體膜表面的錨點(diǎn)沒有利用外泌體的轉(zhuǎn)膜蛋白可信。以下簡(jiǎn)要介紹溶酶體相關(guān)膜蛋白2（lysosomal-associated membrane protein，Lamp2）和血小板衍生的生長因子受體（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR）的研究。

利用未成熟的DC作為工程化外泌體的來源，通過將狂犬病毒糖蛋白（rabies viral glycoprotein，RVG）基因和一種在外泌體膜表面富集的Lamp2b基因融合，然后利用載體轉(zhuǎn)染未成熟的DC，獲得表面表達(dá)融合蛋白的外泌體，靶向神經(jīng)系統(tǒng)中的乙酰膽堿受體，將RVG和Lamp2b的基因融合克隆到載體上并轉(zhuǎn)染未成熟的DC，被展示在外泌體表面的Lamp2b-RVG蛋白將會(huì)靶向神經(jīng)細(xì)胞。提純之后的外泌體利用電穿孔的方法裝載 GAPDH-siRNA，靜脈注射結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠腦中的神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞中的GAPDH基因被敲除，預(yù)暴露于RVG-外泌體并沒有導(dǎo)致敲除削弱，除腦以外的其他組織中并未發(fā)現(xiàn)非特異性的敲除。使用外泌體裝載siRNA靶向**阿爾茨海默病在小鼠實(shí)驗(yàn)中獲得了較好的結(jié)果，與野生型小鼠相比較，靶向**組的小鼠體內(nèi)的β分泌酶1（β-secretase 1，BACE1）的60%水平的mRNA和62%水平的蛋白質(zhì)被敲除。證明外泌體不僅可以獲得性地形成靶向性而且可以穿透血腦屏障，已在**阿爾茨海默病方面顯示出巨大潛力。

　 　利用HEK-293細(xì)胞作為外泌體的來源，利用特殊的pDisplay載體攜帶靶向基因轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞。利用表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）和GE11多肽靶向EGFR高表達(dá)的****細(xì)胞，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法使外泌體加載siRNA（let-7a miRNA）。pDisplay載體中含有PDGFR跨膜區(qū)域，將會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)在質(zhì)膜上的表達(dá)。融合基因中設(shè)置血細(xì)胞凝集素（hemagglutinin，HA）抗體基因標(biāo)簽，以便于后續(xù)的檢測(cè)和篩選。GE11是通過噬菌體展示技術(shù)篩選出的一種含有11個(gè)氨基酸殘基的多肽，能**地靶向結(jié)合于細(xì)胞膜表面的EGFR受體。該實(shí)驗(yàn)靶向性獲得的策略延續(xù)了上述研究，但是該研究利用電穿孔法并不能成功的裝載siRNA到外泌體，認(rèn)為可能是由于細(xì)胞類型不同，分泌的外泌體也有差異。

通過轉(zhuǎn)膜蛋白和歸巢蛋白相融合的策略能將多肽展示在外泌體膜表面，但是也會(huì)有一些問題，例如，展示在外泌體膜表面的歸巢肽有時(shí)會(huì)被細(xì)胞內(nèi)或體液中的蛋白酶降解從而失去其靶向性，在有靶向性的多肽的N端，利用工程手段加入一個(gè)糖基化多肽序列GNSTM可以保護(hù)靶向多肽免遭蛋白酶降解，增加在細(xì)胞和外泌體中的表達(dá)，增強(qiáng)外泌體對(duì)靶細(xì)胞的靶向能力。另一方面，如果歸巢肽相對(duì)分子質(zhì)量太大，當(dāng)其和膜蛋白融合的時(shí)候，會(huì)干擾融合蛋白的表達(dá)或正確折疊，因此尋找受體的核心短片段，盡量減少歸巢肽的相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)于解決外泌體作為靶向**載體的靶向性難題具有重要意義。

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