同位素示蹤技術(shù)的樣本制備及其檢測(cè)

樣本制備

理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果始于精心的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。對(duì)于同位素示蹤實(shí)驗(yàn)，先，穩(wěn)定同位素的選擇很重要，根據(jù)不同研究目的需選擇不同的穩(wěn)定同位素示蹤劑，以下圖表中列出的同位素示蹤劑可供大家根據(jù)各自需求進(jìn)行選擇。此外，實(shí)驗(yàn)中要控制好各種影響因素，比如體內(nèi)實(shí)驗(yàn)要注意飼養(yǎng)、空腹、飲食結(jié)構(gòu)等方面；細(xì)胞培養(yǎng)則要注意培養(yǎng)基的選擇及培養(yǎng)基的更換時(shí)間等；以及同位素示蹤劑的濃度、時(shí)間等等。進(jìn)行同位素示蹤實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要避免代謝物之間的交叉干擾，如特殊營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的更換，其余營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度要注意是否保持一致。標(biāo)記感興趣的通路代謝物時(shí)，需要注意研究較終目的是獲取動(dòng)態(tài)的物質(zhì)濃度還是穩(wěn)態(tài)時(shí)的物質(zhì)濃度。一般而言，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，糖降解過程達(dá)到穩(wěn)態(tài)需要10min，三羧酸循環(huán)（TCA）需要超過2h，到達(dá)核苷酸則需要24h以上，但不同種類的細(xì)胞代謝時(shí)間不同。

   有時(shí)也需要連續(xù)收集樣本去獲取糖降解的動(dòng)態(tài)結(jié)果（如10s為一個(gè)時(shí)間循環(huán)），而TCA可設(shè)定在15min，30min，60min，120min分別收集樣本。其次，是關(guān)于代謝物的收集方法。不同的生物樣本其要求不同，尤其是很多瞬間即逝的重要代謝物，及時(shí)的終止代謝過程、獲得準(zhǔn)確代謝物信息是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。常規(guī)方法包括冷凍或者酶變性法。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)經(jīng)常采用加入低溫有機(jī)溶劑降低代謝活性并促使酶的活性永久變性，而組織樣本可以先-80℃凍存再進(jìn)行低溫有機(jī)溶劑提取。如果低溫有機(jī)溶劑不能立即終止酶活性應(yīng)該怎么解決？如NADPH，ATP等這些高能量物質(zhì)即使緩和降解仍然會(huì)引起NADP、ADP、AMP明顯增加。對(duì)于這類物質(zhì)，可以采用添加酸的有機(jī)溶劑加速酶變性，比如加入0.1 M甲酸的混合溶劑（乙腈：甲醇：水=40：40：20）。較后，要保證樣本收集的一致性。

樣本檢測(cè)

樣本收集后，接下來的挑戰(zhàn)便是盡可能保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。分析技術(shù)主要是NMR及MS技術(shù)，NMR不僅可以確定化合物上被標(biāo)記的碳的數(shù)量（isotopomer），同時(shí)也可確定穩(wěn)定同位素所標(biāo)記上的位置（isotopologue），從而追蹤某一代謝物的不同通路來源，但對(duì)于混合物分析，NMR解譜相對(duì)難度大。如今，越來越多的研究者選擇用MS來檢測(cè)，因?yàn)槠渚哂懈�出色的靈敏度、分辨率及特異性等性能。尤其是氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS），可以利用硬電離（EI）和軟電離（CI）得到不同的代謝物的碎片信息，從而判斷同位素標(biāo)記的不同位置。

同時(shí)，色譜分離對(duì)于同位素示蹤研究尤為重要。色譜分離技術(shù)不僅可以將質(zhì)荷比接近的物質(zhì)分開，防止其他物質(zhì)對(duì)同位素豐度的影響，同時(shí)也可以分離來自不同代謝通路的同分異構(gòu)體，從而得到準(zhǔn)確的代謝通路信息。常見代謝組學(xué)平臺(tái)分為氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）。GC-MS利用其30米，甚至60米的長(zhǎng)色譜柱，通常能較好的分離不同的代謝物。LC-MS通過采用不同的色譜柱可以檢測(cè)不同種類代謝物，如反相色譜柱C18適用于檢測(cè)極性代謝物和脂質(zhì)，HILIC色譜柱可檢測(cè)各類強(qiáng)極性物質(zhì)。

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